原发性干燥综合征患者唇腺组织水通道蛋白5 的表达及意义

王 领 ，张 娜，王艳玲 ，赵福涛

1. 上海交通大学医学院附属第九人民医院风湿免疫科，上海201999；2. 上海市浦东新区公利医院风湿免疫科，上海200135

干燥综合征（Sjögren’s syndrome, SS）是一种慢性自身免疫性疾病，以淋巴细胞浸润外分泌腺为特征，导致腺体分泌功能逐渐丧失，严重者累及腺外器官，引起系统性损害[1]。其病因及发病机制不明，是一种多因素疾病：环境因素触发免疫反应，损害具有遗传易感性个体的唾液腺和泪腺细胞[2]。SS 属于全球性疾病，在我国的患病率为0.29%～0.77%，男女比约为1:9[3]。目前尚无肯定的药物改变SS 的病程。主要是采取措施改善症状，控制和延缓因免疫反应而引起的组织器官损害的进展，预防继发性感染等并发症[4]。近些年发现水通道蛋白5（aquaporin 5, AQP5）在SS 中起着重要的作用，其主要功能为：维持渗透压平衡及调节水液转运；参与腺体分泌及细胞的转移、增殖和凋亡。因此，AQP5 有可能是缓解SS 症状的药物的作用靶点[5]。目前对AQP5 的研究主要局限在啮齿类动物，对其在人体唇腺腺体中的作用还了解甚少。

SS 在临床上分为原发性和继发性2 种。前者指不具有另一个诊断明确的结缔组织病，后者主要继发于其他自身免疫病。原发性SS（primary SS, pSS）的基本病理变化为唾液腺呈灶性CD4+T 淋巴细胞浸润，B 淋巴细胞高反应性，临床上可以看到多数pSS 患者体内存在着高免疫球蛋白血症[6]。因此，常用红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate, ESR）、免疫球蛋白G（immunoglobulin, IgG）以及唇腺组织病理的淋巴细胞浸润程度来提示pSS患者的病情活动。血清白细胞介素-21（interleukin-21, IL-21）作为一种多效性的细胞因子，在多种自身免疫性疾病中均表现出明显的致病性。既往研究[7]显示，SS 患者中血清IL-21 表达水平增高，且与唇腺组织中淋巴细胞的浸润程度有关，提示IL-21 可能参与了pSS 的发病过程。β2微球蛋白（β2-microglobulin, β2-MG）主要由淋巴细胞合成，被发现在SS 患者的血清和唾液中含量明显升高，且与唇腺活检中淋巴细胞浸润程度呈正相关[8]。

因此，为探讨唇腺AQP5 的表达与血清IL-21、β2-MG 及病情活动的关系，本研究拟对pSS 患者进行微创唇腺活检，用免疫组织化学（免疫组化）检测唇腺中AQP5 的表达，采用ELISA 方法检测患者血清中IL-21 和β2-MG 的水平，同时检测ESR、IgG 等炎症指标的水平，并对AQP5 与IL-21、β2-MG、ESR、IgG 的相关性进行分析，以期为判断pSS 患者的病情活动提供一种重要的生物学标志物，便于临床评估病情和指导治疗。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2016 年7 月—2018 年1 月在上海交通大学医学院附属第九人民医院风湿免疫科门诊初诊且未经治疗的pSS 患者39 例。纳入标准：符合2002 年SS 分类标准[9]。排除标准：合并急慢性感染及恶性肿瘤患者。39例患者中，男性1 例，女性38 例，年龄26 ～79 岁，平均年龄52.74 岁。在签署知情同意书后，对患者进行唇腺活检，并采集晨起空腹血清。本研究经上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会审批通过（编号HKDL2017295），所有患者资料完整且来源真实可靠。

1.2 研究方法

1.2.1分组方法 所有研究对象均行唇腺活检。唇腺腺体经中性福尔马林液固定24 h 后石蜡包埋，制成4 μm 切片，常规脱蜡后行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, H-E）染色。病理标本由病理科医师和临床医师于倒置显微镜下共同完成观察，每例患者1 张片子，5 个视野。对结果有分歧的标本，请高年资病理医师再次审核。根据Chisholm唇腺病理分级标准[10]，将所有标本分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个等级，分别代表少量淋巴细胞浸润、中等量淋巴细胞浸润、1 个淋巴细胞灶浸润、多个淋巴细胞灶浸润（4 mm2组织内至少50 个淋巴细胞聚集于唇腺间质为1 个灶）。根据不同等级相应分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4 组。

1.2.2免疫组化检测 按照AQP5 免疫组化试剂盒操作步骤进行AQP5 表达的检测，步骤简述如下。将包埋好的石蜡标本进行切片，并进行脱蜡及抗原热修复。PBS 洗涤后，使用5% BSA（上海碧云天生物技术有限公司）进行封闭，使用AQP5 抗体（美国Aきnity 公司，1:200 稀释）4℃孵育过夜；PBS 洗涤后加入山羊抗兔IgG 抗体（美国Jackson 公司），并添加辣根酶标记链霉卵白素工作液（北京中山金桥生物公司），PBS 洗涤3 次后，进行DAB（中国武汉博士德生物工程有限公司）显色。AQP5 表达阳性的细胞呈棕黄色，在倒置显微镜下每张切片取5 个不同视野，在相同面积下用Image-Pro-Plus 6.0 软件进行光密度（optical density, OD）计算。

1.2.3ELISA 检测 收集患者新鲜静脉血标本，900×g 离心10 min，将血清转移至EP 管中。依据ELISA 试剂盒操作方法检测血清IL-21（美国Santa Cruz 公司）、β2-MG（厦门慧嘉生物科技有限公司）水平。步骤简述如下：按要求对标准品进行倍比稀释并加样，将稀释后的血清样品加入酶标板底部。标准品及样品加样均为100 μL/孔；用封板膜封住反应孔，室温孵育120 min；揭掉封板膜，弃掉液体，甩干后加入工作浓度洗涤液，洗涤重复4 ～5次。每孔加入酶标抗体100 μL/孔，孵育1 h。洗涤后加入酶结合物100 μL，孵育并洗涤后，加入显色剂TMB 溶液100 μL/孔，孵育20 min 后加入终止液50 μL/孔，混匀后立即使用酶标仪测量D （450 nm）值。根据标准品绘制标准曲线，并计算IL-21、β2-MG 表达水平。

1.2.4ESR、IgG 的测定 采用魏氏法检测ESR，散射比浊法测定IgG。ESR、IgG 均由上海交通大学医学院附属第九人民医院检验科检测。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件进行数据分析。统计描述采用M（Q1, Q3）表示。对于不服从正态分布或方差不齐的定量资料采用秩和检验；相关性分析采用Spearman 等级相关。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 病理分级

根据Chisholm 唇腺病理分级分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，各组H-E 染色结果显示：Ⅰ、Ⅱ级唇腺组织腺泡大小均匀，导管排列整齐，无扩张，间质无或少量炎性细胞浸润（图1A、B）；Ⅲ、Ⅳ级唇腺组织腺泡大小不等，部分腺体萎缩，以导管周围为主，间质有1 个或数个淋巴细胞灶浸润（图1C、D）。

2.2 唇 腺 组 织AQP5 的 表 达 及IL-21、β2-MG、ESR、IgG 浓度

唇腺腺体免疫组化检测结果显示：AQP5 的表达水平随着唇腺组织淋巴细胞数目的增加而减少。Ⅰ、Ⅱ组AQP5 表达主要在腺上皮及导管（图2A、B）；Ⅲ、Ⅳ组AQP5 表达减弱，主要分布在导管区（图2C、D）；4 组之间AQP5 表达的差异有统计学意义（P=0.000）。随着唇腺组织淋巴细胞浸润的增加，IL-21 浓度、β2-MG 浓度、ESR 值、IgG 浓度增加；4 组之间IL-21、ESR、IgG 的差异有统计学意义，β2-MG 差异无统计学意义（表1）。

图1 Chisholm 唇腺病理分级（H-E 染色，×100）Fig 1 Pathological grades of Chisholm labial glands （H-E staining, ×100）

表1 各组唇腺组织AQP5 的OD 值、IL-21 浓度、β2-MG 浓度、ESR 值和IgG 浓度Tab 1 OD of AQP5 in labial gland tissue, concentration of IL-21, β2-MG and IgG, and value of ESR of each group

2.3 唇 腺 组 织AQP5 的 表 达 与IL-21、β2-MG、ESR、IgG 的相关性

将AQP5 的表达 水 平与IL-21、β2-MG、ESR、IgG进行相关性分析，结果表明，AQP5 的表达与IL-21、β2-MG、ESR、IgG 均呈负相关（表2）。

表2 唇腺组织AQP5 的表达与IL-21、β2-MG、ESR、IgG 的相关性Tab 2 Correlation of AQP5 expression with IL-21, β2-MG, ESR and IgG in labial glands

3 讨论

近年来，随着对AQP5 研究的深入，其在pSS 发病中的作用得到肯定。AQP5 对水具有高度通透性，受自主神经的调控，在唾液腺中大量表达[11]。它含有蛋白激酶A（protein kinase A, PKA）和蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）磷酸化后的同源序列，受磷酸化作用的直接调节；在某些条件下，AQP5 磷酸化后增加了细胞膜对水的通透性[12]。有研究[13]认为AQP5 表达异常会导致唾液、泪液分泌障碍。本研究从pSS 患者的唇腺组织淋巴细胞浸润程度来探讨AQP5 的表达水平与IL-21、β2-MG、ESR、IgG的关系。研究结果发现，随着唇腺组织淋巴细胞浸润的增加，AQP5 的表达水平降低，推测可能与患者口干症状有关。且进一步的相关性分析表明，AQP5 的表达与IL-21、β2-MG、ESR、IgG 呈负相关。

IL-21 由滤泡辅助性T 细胞、Th17 细胞以及NK 细胞产生，可促进T、B 淋巴细胞增殖[14]。SS 患者的靶器官和血液之中，效应T 细胞及其多种细胞因子的数量显著增加。有学者[15]发现，SS 患者外周血淋巴细胞及唇腺组织中IL-21 受体表达明显高于其他结缔组织病和健康对照组，并且IL-21 受体水平与类风湿因子、IgG、唇腺淋巴细胞浸润程度呈正相关。本研究发现随着pSS 患者唇腺组 织淋巴细胞浸润的增加，血清IL-21 表达水平逐渐升高，因此，我们推测IL-21 与pSS 的发生发展和病情活动度有关。

β2-MG 含量少且恒定，可参与抗原提呈过程，但其在SS 中所起的作用仍不完全清楚，其水平可能代表免疫反应的整体活化程度[16]。有研究[17]表明，β2-MG 与自身抗体和系统受累有关，可作为pSS 病情活动的观察指标。本研究发现血清β2-MG 水平随着唇腺组织淋巴细胞浸润的增加，而逐渐升高，但各组间差异无统计学意义。产生该结果的原因，可能与样本量少，分组类别及无健康对照组有关。

AQP5 的信号通路之一为Toll 样受体4（Toll like receptor, TLR4）/髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88, MyD88）/核因子κB（nuclear factor κB, NF-κB）/AQP5 信号通路。NF-κB 的激活可以使AQP5 低表达，而NF-κB 是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路的下游调节因子[5]。IL-21 受体信号可激活MAPK 信号通路，进而在介导细胞增殖中发挥重要作用[18]。并且编码β2-MG 的基因中，有1 个保守的调控元件为NF-κB 样位点，作用是启动增强子转录[19]。这说明AQP5 和IL-21、β2-MG 在信号通路上存在交叉，而在本研究中，AQP5 的表达与IL-21、β2-MG 呈负相关。因此，进一步研究其联系机制，明确AQP5 及其信号通路在pSS 发病过程中的作用，对临床诊疗具有重要意义。

综上所述，本研究结果表明pSS 患者随着唇腺组织淋巴细胞的浸润增多，AQP5 表达减少，IL-21、β2-MG、IgG 表达增加，ESR 增快，且AQP5 水平与IL-21、β2-MG、ESR、IgG 呈负相关。推测AQP5、IL-21、β2-MG与pSS 病情活动存在相关性。因此，AQP5 联合IL-21、β2-MG 有望成为监测pSS 病情活动的生物学标志物。由于患者的数量受限及统计的参数较少，没有进一步探讨AQP5 在pSS 中的发病机制，有待后续大样本的进一步研究，为治疗SS 提供新的思路。

参·考·文·献

[1] Both T, Dalm VA, van Hagen PM, et al. Reviewing primary Sjögren's syndrome: beyond the dryness— From pathophysiology to diagnosis and treatment[J]. Int J Med Sci, 2017, 14(3): 191-200.

[2] Nikolov NP, Illei GG. Pathogenesis of sjögren's syndrome[J]. Curr Opin Rheumatol, 2009, 21(5): 465-470.

[3] Patel R, Shahane A. The epidemiology of Sjögren's syndrome[J]. Clin Epidemiol, 2014, 6: 247-255.

[4] 张文, 厉小梅, 徐东, 等. 原发性干燥综合征诊疗规范[J]. 中华内科杂志, 2020, 59(4): 269-276.

[5] 沙明慧, 吴素玲. 水通道蛋白5 在干燥综合征中的作用综述[J]. 药学与临床研究, 2019, 27(2): 113-116.

[6] 中华医学会风湿病学分会. 干燥综合征诊断及治疗指南[J]. 中华风湿病学杂志, 2010, 14(11): 766-768.

[7] Kang KY, Kim HO, Kwok SK, et al. Impact of interleukin-21 in the pathogenesis of primary Sjögren's syndrome: increased serum levels of interleukin-21 and its expression in the labial salivary glands[J]. Arthritis Res Ther, 2011, 13(5): R179.

[8] Carpenter GH, Proctor GB, Pankhurst CL, et al. Sialochemical markers of salivary gland involvement with Sjögren's syndrome secondary to rheumatoid arthritis and primary biliary cirrhosis[J]. J Oral Pathol Med, 2000, 29(9): 452-459.

[9] Vitali C, Bombardieri S, Jonsson R, et al. Classification criteria for Sjögren's syndrome: a revised version of the European criteria proposed by the American-European Consensus Group[J]. Ann Rheum Dis, 2002, 61(6): 554-558.

[10] Chisholm DM, Mason DK. Labial salivary gland biopsy in Sjögren's disease[J]. J Clin Pathol, 1968, 21(5): 656-660.

[11] Aure MH, Ruus AK, Galtung HK. Aquaporins in the adult mouse submandibular and sublingual salivary glands[J]. J Mol Histol, 2014, 45(1): 69-80.

[12] Németh-Cahalan KL, Kalman K, Hall JE. Molecular basis of pH and Ca2+regulation of aquaporin water permeability[J]. J Gen Physiol, 2004, 123(5): 573-580.

[13] Sumida T, Tsuboi H, Iizuka M, et al. The role of M3 muscarinic acetylcholine receptor reactive T cells in Sjögren's syndrome: a critical review[J]. J Autoimmun, 2014, 51: 44-50.

[14] Ozaki K, Spolski R, Ettinger R, et al. Regulation of B cell differentiation and plasma cell generation by IL-21, a novel inducer of Blimp-1 and Bcl-6[J]. J Immunol, 2004, 173(9): 5361-5371.

[15] Maehara T, Moriyama M, Nakashima H, et al. Interleukin-21 contributes to germinal centre formation and immunoglobulin G4 production in IgG4-related dacryoadenitis and sialoadenitis, so-called Mikulicz's disease[J]. Ann Rheum Dis, 2012, 71(12): 2011-2019.

[16] Shields MJ, Kubota R, Hodgson W, et al. The effect of human β2-microglobulin on major histocompatibility complex Ⅰ peptide loading and the engineering of a high aきnity variant. Implications for peptide-based vaccines[J]. J Biol Chem, 1998, 273(43): 28010-28018.

[17] 王晓东. 干燥综合征患者血清β2 微球蛋白水平与自身抗体及系统受累的关系[J]. 中国现代医生, 2017, 55(21): 7-13.

[18] Tian Y, Zajac AJ. IL-21 and T cell differentiation: consider the context[J]. Trends Immunol, 2016, 37(8): 557-568.

[19] 陈月梅. β2-微球蛋白检测试剂的研发及临床应用[D]. 长沙: 中南大学, 2012.