基因工程在重组激素生产中的应用

（上海市吴淞中学，上海 200940）

0.引言

近年来，生物技术在制药工业中得到了广泛应用。应用基因工程技术，可以高效地生产激素、细胞因子、抗体等重组蛋白。目前，已经有超过75种重组蛋白被用作药物，有360多种基于重组蛋白的新药物处于临床试验阶段[1]。

重组激素是一类十分重要的重组蛋白药物。目前，与重组激素生产相关的基因工程技术已经十分成熟。科学家可以设计生物活性更高、半衰期更长的重组激素。然而，在生产重组激素的过程中，科学家遇到了一些较为普遍的问题。如何改进现有技术，提高激素的疗效，降低激素的生产成本，是一个十分关键的问题。

1.基因工程

运用科学手段将从某种生物中人工分离特定的DNA片段，将其导入另一种生物中，使生物体的性状发生可遗传改变，这就是基因工程。基因工程在农业、工业、医药等领域都有着十分广泛的应用。

1.1 基因工程的主要工具

科学家在研究生物大分子的过程中，发现了大量可以切割、连接DNA双链的酶。应用这些酶，可以重组来自不同生物的DNA分子，对于构建符合人类需求的重组细胞是至关重要的。此外，科学家还发现，细菌体内能自主复制的环状DNA分子—质粒可以成为基因工程中的重要载体[2]。

1.1.1 工具酶

限制性核酸内切酶可以在特定位点切割DNA分子，在获取目的基因的过程中，限制性核酸内切酶发挥着重要的作用。目前，人类已经发现了数千种限制性核酸内切酶。使用能够连接DNA分子的酶—DNA连接酶，可以将外源DNA与载体相连接。在连接DNA与载体后，筛选连接成功的重组DNA分子。

1.1.2 载体

质粒是最常见的载体。质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性核酸内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作[3]。

1.2 应用基因工程生产重组蛋白

在应用基因工程技术生产重组蛋白的过程中，科学家需要从细胞中获得的待克隆的DNA链（目的基因），将其与质粒连接在一起，形成环状结构。将重组质粒导入大肠杆菌或其他受体细胞，使基因在受体细胞内高效表达，从而合成大量所需蛋白质。为了成功表达重组基因并产生重组蛋白质，科学家可能需要改造编码蛋白质一级结构的DNA序列，然后加上控制启动、终止转录过程的其他序列[5]。

2.基因工程在重组激素生产中的应用

2.1 重组人类生长激素

应用基因工程技术，可以高效地生产重组人生长激素（rhGH）。1979年，Goeddel等人成功利用大肠杆菌表达出人类生长激素（hGH）。目前，Somatrem（一种基因重组生长激素）已获得FDA的批准，用于治疗多种人类疾病。据估计，每周约有4000～5000名儿童接受这种激素的治疗。Somatonorm的结构与垂体产生的天然hGH十分相似，其生理活性较高。许多临床研究表明，两种hGH制剂的生物学作用几乎完全相同。多项药理学和毒理学研究表明，Somatonorm几乎不会引起人体的不良反应[6]。

2.1.1 rhGH的生产

在生产人类生长激素的过程中应用的目的基因部分是通过人工合成产生的，部分是通过人类垂体细胞的mRNA反转录产生的。科学家通过人工合成方法，获得编码前23个氨基酸的核苷酸序列，这部分序列来自hGH的已知氨基酸序列，含有翻译起始密码子；将垂体mRNA逆转录为cDNA，可以得到编码第24-191个氨基酸的核苷酸序列。将核苷酸序列的两个部分融合，并将其插入到表达质粒phGH407中，用该质粒转化大肠杆菌K12RV308，向孵育培养基中添加四环素，可以筛选出转化成功的重组细菌，因为只有含质粒的生物可以在含有四环素的培养基中存活。进行常规发酵后，将细胞与培养液分离并匀浆以破坏细胞壁，离心去除细胞壁和碎片后，剩余的裂解物中含有大量的hGH，不过，还需要裂解物进行纯化，才能得到高纯度的hGH[7]。

2.1.2 rhGH的纯化

在生产rhGH的过程中，去除裂解物中的大肠杆菌多肽（ECP）是非常重要的。不同的蛋白质的分子量和所带电荷不同，离子交换色谱可以分离带有不同电荷的蛋白质，凝胶过滤可以分离分子量不同的蛋白质。因此，可以应用离子交换色谱和凝胶过滤等常规色谱方法，有效去除裂解物中的ECP，提高rhGH的纯度，降低不良反应发生率。获得rhGH纯化产物后，进行无菌过滤，将终产物放入玻璃小瓶中并冻干，即可得到rhGH成品。

载体质粒和宿主细胞的稳定性和完整性是生产rhGH的发酵过程中关键指标。核酸实验表明，在细胞复制25代后，转入基因仍然是非常稳定的。科学家还测试了细胞对四环素、链霉素的抗性以及发酵半乳糖的能力，评估大肠杆菌细胞的基因组稳定性。多数研究表明，载体质粒和宿主细胞在整个发酵过程中都是较为稳定的[8]。

2.2 人重组卵泡刺激素（rhFSH）

2.2.1 促卵泡激素的简介

促卵泡激素（FSH）是垂体分泌的一种复杂的异二聚体糖蛋白，与男性和女性性腺中生殖细胞的发育密切相关。人类FSH药物制剂在治疗人类不孕不育中发挥着重要的作用。FSH可以刺激卵泡发育，促进妇女排卵，增加受孕的可能性。如今，FSH已经成为刺激体内多卵泡发育的常规治疗方法，在得到成熟的卵细胞后，可以通过体外受精（IVF）和胚胎移植等辅助生殖技术，获得将生理活性高的胚胎并将其移植到妇女体内，提高怀孕的几率。在男性体内，FSH可以与人绒毛膜促性腺激素（HCG）结合，促进精子生成。因此，FSH还可以用于治疗与性腺功能减退相关的不育症[9]。

最初，科学家从垂体中提取可以用于临床的人FSH，事实上，这是20世纪60年代治疗与排卵相关的不孕症的主要方法。此后不久，一些研究人员发现，从绝经妇女尿液中提取的FSH也是有效的，这种方法降低了FSH生产成本。然而，人体体液中的FSH含量较低，提取步骤较多，工艺十分复杂，应用这种方法生产的FSH不能满足临床需求。研发安全和疗效更高的新型FSH治疗剂，成为了科研人员面临的主要问题之一。

2.2.2 天然FSH的特征

天然的FSH是一种糖蛋白，包含两种不同的亚基（α亚基和β亚基）。基因工程生产的不同亚基，经过内质网糖基化加工后，以特定的形式结合为异二聚体，并进行翻译后修饰。等电聚焦分析和色谱聚焦分析表明，从垂体、血清或尿液中分离出的人FSH的性质不同。这些同工型FSH带有不同的电荷，它们的受体结合能力和体内半衰期也有一定的差异，这种差异可能与天冬酰胺连接的寡糖类型相关[10]。

2.2.3 应用基因工程生产rhFSH

应用基因工程技术，科学家可以改造哺乳动物细胞，从而高效地生产用于临床治疗的人FSH。在应用基因工程技术生产重组人FSH时，选择合适的工程细胞是非常重要的，原核细胞无法形成二硫键，不能对肽链进行复杂的翻译后修饰，因此，科学家通常用真核细胞生产FSH。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是广泛使用的生产FSH的工程细胞，它能够对肽链进行翻译后修饰，合成生物活性较高的rhFSH。科学家通常将人FSH基因导入CHO细胞，使其高效地表达人FSH，并应用先进的蛋白质纯化工艺（免疫亲和纯化或高效液相色谱）对培养液进行纯化，提取能够用于临床治疗的高纯度rhFSH[11]。

在应用基因工程生产rhFSH的过程中，科学家遇到了一些问题，FSH的结构十分复杂，它的亚单位内富含由二硫键和与天冬酰胺连接的寡糖链，这些特殊的结构对维持激素的生物学活性是至关重要的。在生产过程中，还原剂可能会破坏二硫键，降低FSH制剂的活性。在体外实验中，缺乏糖链的rhFSH不具有信号传导功能，而体内唾液酸化作用则可能导致rhFSH末端半乳糖部分的暴露，降低其体内活性。因此，在生产rhFSH的过程中，必须保持所有翻译后修饰的完整性。必须选择哺乳动物细胞作为工程细胞，才能保证产物的结构的完整性。此外，在导入基因时，科学家一般将编码3个亚基的FSH基因分别导入工程细胞，并在这些序列前面插入不同的基因元件，从而确保这些基因的表达产物能够形成结构完整的rhFSH[12]。

3.重组激素生产中的典型问题

3.1 表达下降

大规模生产重组激素的必要条件是目的基因的有效表达。但是，由于在进行基因重组的过程中，目的基因的结构可能会发生变化，在进入新细胞后，目的基因的表达量可能会逐渐下降。这可能与所选的质粒或病毒的种类和基因整合位点有关。

3.2 翻译后修饰

许多天然激素的结构十分复杂，它们含有大量的二硫键和糖链，这些结构有助于维持激素的生物学活性。在生产重组蛋白的过程中，一些新生多肽链不能在工程细胞中构成正确的空间结构，甚至形成天然不溶性折叠中间体，这可能影响产物的疗效，提高重组激素的生产成本。此外，一些用细菌细胞生产的新生多肽链缺乏糖链修饰，这可能重组激素无法与细胞上的受体结合，影响其疗效。

许多科学家致力于解决重组激素生产中的问题。他们发现，正确选择基因载体、在目的基因的上游插入合适的元件，对维持目的蛋白的表达水平十分重要[13]。此外，应用哺乳动物细胞生产的激素大多具有与天然激素相似的结构和生物学活性，然而，哺乳动物细胞的培养成本较高，如何改进生产技术，平衡产品质量与生产成本问题，是将基因工程广泛应用于合成药物生产所面临的重要挑战。

4.结语与展望

基因工程在制药领域有着广泛的应用。目前，重组激素的制备技术已经非常成熟，科学家应用多种基因表达系统，成功地生产了数百种重组激素。应用基因工程技术生产重组激素，可以大大提高产物的纯度，扩大生产规模，降低生产成本。此外，适当改造编码激素的基因，可以延长激素在体内的半衰期，降低不良反应的发生率。目前，已经有数百种重组激素处于临床试验阶段。可以说，重组激素有着极高的商业价值，重组激素将成为需求增长最快的重组蛋白药物之一[14]。研发人员应当深入研究重要工程菌性状表现的机制，以及影响基因表达调控的因素，不断改进现有技术，提高产物的生物活性和稳定性，降低激素的生产成本。制药公司需要在重组激素研发方面投入更多的资金，助力激素产业的发展。