人参皂苷Rg3调控lncRNA-LINP1抑制胃癌细胞生长的作用机制

唐 立，徐惠亮，郝双影

0 引 言

胃癌是一种常见癌症，全球每年新发病例数超过10万，约有738 000多人死于胃癌[1]。目前，已有多种治疗策略可用于治疗胃癌患者，例如化学疗法、放射疗法或两者结合。尽管早期胃癌的治疗已有进展，但预后仍然很差，并且有很多患者死于胃癌复发[2-3]。

近年来，天然产物化合物由于其有显著的抗癌效果和较小的不良反应，越来越被研究者重视[4]。人参皂苷Rg3是一种从人参中提取出来的二醇类三萜皂苷，具有诱导细胞凋亡、增殖和迁移的能力[5-6]。其中Rg3表现出对肿瘤细胞增殖、转移的抑制，并且能诱导肿瘤细胞凋亡。非编码lncRNA-LINP1 ( lncRNA-LINP1) 是一种长度≥200 nt的RNA，在肿瘤细胞增殖与迁移过程中扮演重要角色[7]。研究发现lncRNA-LINP1参与胃癌细胞浸润、转移过程[8-9]，但是关于其作用的具体机制鲜有报道。本研究旨在探究人参皂苷Rg3通过调控lncRNA-LINP1表达，从而抑制胃癌细胞生长的机制。

1 材料与方法

1.1 材料人胃癌细胞株SNU-1细胞购自中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，人参皂苷Rg3购自乐嘉生物科技公司，胎牛血清和DMEM培养基购自广州生物硕恒科技有限公司，Annexin V FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自南京卡米洛生物工程有限公司。

1.2细胞分组与处理在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养人胃癌细胞SNU-1，培养箱参数设为是37 ℃，5%CO2。根据人参皂苷Rg处理浓度[10]分为：对照组(0 μmol/L人参皂苷Rg3)、低剂量组(0.03 μmol/L人参皂苷Rg3)、中等剂量组(0.06 μmol/L人参皂苷Rg3)和高剂量组(0.09 μmol/L人参皂苷Rg3)，DMSO终浓度<0.1%。

1.3采用MTT法检测细胞增殖各组SNU-1细胞种植在96 孔板中，种植密度设为6 ×103个细胞/孔。各组细胞分别处理24 h、48 h和72 h后，每孔中加入28 μL 0.5 mg/mL MTT溶液，然后继续培养6 h。培养完成后，震荡8 min，于450 nm波长处用酶标仪检测吸光度值，从而得到增殖抑制率，计算公式如下：

增殖抑制率=(1-实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100%

1.4采用Annexin-FITC双染法检测细胞凋亡药物处理细胞48 h后，使用不含EDTA的胰蛋白酶进行消化，PBS清洗2次后，每组收集105个细胞轻轻吹打重悬，加入10 μL Annexin-FITC和10 μL PI，使用流式细胞仪测出各组细胞的凋亡率。细胞凋亡率计算公式如下：

细胞凋亡率=(UR象限细胞数+LR象限细胞数)/细胞总数×100%

1.5采用细胞划痕实验检测细胞迁移将各组细胞接种在6孔培养板中，浓度为 106个/孔，处理48 h，使用无菌枪头在培养皿中均匀划痕，然后使用PBS(1×)洗涤细胞4次，将各组细胞加入培养基后拍照记录，此时定义时间为0 h时各组细胞的迁移状况。继续放置在培养箱中，24 h后显微镜下观察并且拍照记录。

1.6采用RT-PCR检测lncRNA-LINP1表达水平分别将各组细胞处理24 h、48 h、72 h后，收集各组细胞，使用Trizol法提取总RNA。以β-actin作为内参，采用RT-PCR检测lncRNA-LINP1在各组细胞中表达水平。使用引物(5′- 3′)：lncRNA-LINP1上游引物为：GTCTCCTAGACTCTGGGT，下游引物为：TAAAATGTTGAGAACGAC；β-actin上游引物：ACGAGACCIACCTTCAACTCCATC；下游引物：TAGAAGCATTTGCGGTGGACGA。上述实验重复6次。

2 结 果

2.1 人参皂苷Rg3抑制lncRNA-LINP1的表达低剂量组、中等剂量组和高剂量组lncRNA-LINP1的表达水平明显低于对照组(P<0.05)，高剂量组lncRNA-LINP1的表达水平明显低于低剂量组和中等剂量组(P<0.05)。见图1。

与同时间点对照组比较，*P<0.05；与同时间点低剂量组比较，#P<0.05；与同时间点中等剂量组比较，△P<0.05

2.2人参皂苷Rg3抑制胃癌细胞增殖处理后24 h、48 h、72 h，高剂量组癌细胞增殖能力最弱，增殖抑制率高于低剂量组和中等剂量组(P<0.05)，见表1。

表 1 各组不同时间点的SNU-1细胞增殖抑制率

2.3人参皂苷Rg3促进胃癌细胞的凋亡低剂量组、中等剂量组、高剂量组细胞凋亡率[(4.56±0.92)%、(8.77±0.98)%、(15.06±2.42)%]明显高于对照组[(2.43±0.74)%]，差异有统计学意义(P<0.05) ；且随着人参皂苷Rg3 浓度增加，细胞凋亡率上升(P<0.05)。见图2。

2.4人参皂苷Rg3抑制胃癌细胞迁移细胞划痕实验结果显示，不同浓度人参皂苷Rg3处理48h后，低剂量组、中等剂量组和高剂量组细胞的迁移距离均明显小于对照组，且随着人参皂苷Rg3浓度增加，细胞迁移距离缩短。见图3。

图 2 人参皂苷Rg3对胃癌细胞凋亡的影响

a:对照组; b:低剂量组; c:中等剂量组; d:高剂量组

3 讨 论

目前普遍认为细胞的恶性增殖是癌症发生的必要环节，近年来对胃癌的研究发现，lncRNA调控基因的表达量[11]，进一步影响细胞分化[12]及凋亡[13]。从人参皂苷中分离出Rg3，近来研究表明人参皂苷Rg3可显著抑制肺癌细胞[14]、人骨髓瘤细胞[15]、结肠癌癌细胞生长[16]，但尚无研究表明人参皂苷Rg3对胃癌的治疗作用。本研究利用MTT法检测不同浓度、不同时间人参皂苷Rg3对SNU-1细胞增殖的影响，发现人参皂苷Rg3能明显抑制SNU-1细胞增殖，且抑制作用随着浓度的升高而增加；进一步我们利用流式细胞技术检测人参皂苷Rg3对SNU-1细胞凋亡的影响，人参皂苷Rg3处理48 h后能显著诱导SNU-1细胞凋亡，且与作用浓度呈正相关；此外，细胞迁移实验表明，不同浓度人参皂苷Rg3处理48 h后，SUN-1细胞迁移的距离明显缩短，对照组最长，高剂量组最短；同时，本研究检测了人参皂苷Rg3对胃癌细胞系lncRNA-LINP1表达的影响，阐述了人参皂苷Rg3对lncRNA-LINP1表达的抑制作用，这种抑制作用与药物浓度呈正比。这些结果表明，人参皂苷Rg3可显著促进胃癌细胞凋亡，抑制胃癌细胞增殖迁移，这种作用可能与lncRNA-LINP1相关，这将为利用人参皂苷Rg3 治疗胃癌提供可靠参考。

lncRNA-LINP1存在于细胞核中，它主要参与染色体修饰、转录沉默、转录激活等重要生理功能。研究发现，lncRNA-LINP1在骨肉瘤组织中表达升高，如果对lncRNA-LINP1进行抑制，癌细胞的增殖和侵袭能力会明显下降。此外，在胰腺癌中，过表达的lncRNA-LINP1使得癌细胞的迁移和侵袭能力显著升高[6,17]。近期研究表明，lncRNA-LINP1在肝癌组织中的表达上调，并且lncRNA-LINP1的表达水平与肝癌患者不良预后密切相关，但目前关于其在胃癌中参与的分子机制、药物敏感性却鲜有探究[17]。本研究显示，处理后24 h、48 h、72 h对照组中lncRNA-LINP1的表达水平、细胞增殖指数都高于人参皂苷Rg3处理组，而高剂量组是各组中胃癌细胞受抑制最明显的实验组，说明人参皂苷Rg3能抑制胃癌细胞增殖，而且抑制能力与使用人参皂苷Rg3的剂量显著相关。

综上所述，本次实验发现了人参皂苷Rg3能抑制胃癌细胞增殖及迁移，促进胃癌细胞凋亡，且这种作用可能与调控lncRNA-LINP1的表达相关，这为治疗胃癌提供了新的药物选择。