靶向抑制CDK6 对人卵巢癌细胞凋亡的影响

段丽 王莉莉 冯雪 王冠 邢焱玲 孙杰 颜莹

卵巢癌是严重危害女性健康的常见恶性肿瘤，患者存活几率较低。卵巢癌常用的主要治疗手段包括手术辅助化疗和放疗。近年来，尽管卵巢癌的治疗手段和措施有了很大改进，但卵巢癌依然具有很高的死亡率。随着生物技术的发展，挖掘治疗卵巢癌的有效新型靶点受到许多研究者的关注[1]。细胞过度增殖与肿瘤的发生关系密切，细胞周期发生异常调控常导致细胞出现过度增殖现象。在细胞生命周期中，细胞周期蛋白依赖性激酶6（cyclin-dependent kinases 6，CDK6）是哺乳动物细胞周期调控的关键因子，在人类大多数肿瘤组织细胞中均过度表达，一直受到研究者的关注[2]。研究表明，早期卵巢癌发生和发展常伴随着CDK6 的过度表达，CDK6基因被靶向抑制后，人卵巢癌细胞的增殖和粘附能力能够获得有效抑制[3]。本研究拟进一步探讨CDK6 被靶向抑制后，人卵巢癌细胞凋亡水平的变化，以期为挖掘卵巢癌的基因治疗靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料

人卵巢癌细胞系HO-8910 株购买自哈尔滨医科大学第二附属医院中心实验室。CDK6 基因shRNA 表达载体由兽医生物技术实验室保存和鉴定，CDK6 基因和β-actin 基因扩增引物由哈尔滨博仕生物技术有限公司设计、合成。FuGENE HD 转染试剂盒、荧光RT-PCR 试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒分别购自德国Roche 公司、美国AB 公司和南京凯基生物。CDK6 基因的shRNA 由上海吉玛制药技术公司设计，PGPU6/GFP/CDK6-608（shRNA-608）和无关序列PGPU6/GFP/shNC（shNC）为本实验室构建、保存。本研究经过黑龙江省医院伦理委员会审查和批准。

1.2 研究方法

1.2.1 CDK6-shRNA 转染人卵巢癌HO-8910 细胞 将卵巢癌HO-8910 细胞复苏后，培养至对数生长期状态时，接种24 孔培养板，每孔细胞密度为5×105/mL，待细胞培养至80%左右融合时，根据转染试剂盒说明书中的步骤，把重组质粒与转染试剂混合，一起转染HO-8910 细胞。实验共分3 组：未进行转染的空白细胞对照组（未转染组）、无关序列转染细胞组（shNC 组）、阳性质粒转染细胞组（shRNA-608 组）。

1.2.2 RT-PCR 检测CDK6 mRNA 表达 在转染后48 h 时，进行细胞收集，根据细胞RNA 提取试剂盒的说明书，分别提取各组试验细胞的总RNA。根据荧光定量RT-PCR 说明书进行CDK6 基因的反转录和PCR 扩增，用β-actin 作为内参对照，β-actin 基因引物和CDK6 基因的引物参考文献[3]。

1.2.3 流式细胞术（flow cytometer，FCM）检测细胞凋亡 将各组细胞消化后，制备成单细胞悬液，细胞浓度为5×105/mL，按照试剂盒说明书进行处理，避光室温孵育10 min，1 h 内用流式细胞仪进行检测和分析。

1.3 观察指标

1.3.1 荧光表达观察 使用荧光显微镜观察未转染组、shNC 组、shRNA-608 组细胞是否有荧光表达。

1.3.2 RT-PCR 检测CDK6 mRNA 表达 使用RT-PCR 方法检测3 组细胞CDK6 基因的表达情况。

1.3.3 流式细胞术（flow cytometer，FCM）检测细胞凋亡 使用流式细胞仪分别检测各组细胞凋亡的情况。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件对收集的数据进行统计分析，本研究中涉及3 组间的分析，采用单因素方差检验进行数据比较，当P＜0.05 时，组间差异有统计学意义。

2 结果

2.1 质粒转染后荧光观察结果

无关序列组及shRNA-608 转染组细胞均观察到绿色荧光，细胞转染效率均达到80%，而未转染空白组细胞无荧光表达。

2.2 shRNA 抑制CDK6 基因mRNA 表达结果

应用荧光定量RT-PCR 检测转染48 h 时细胞CDK6 mRNA的相对表达情况，为避免操作等因素引起的差异，每组均设3个重复细胞孔，进行RNA 检测。结果显示，与shNC 组和空白对照组比较，shRNA-608 组CDK6 mRNA 表达显著被抑制（P ＜0.001），抑制率为（48.15±0.59）%；shNC 组与未转染组比较，CDK6 mRNA 表达量差异无统计学意义（P ＝0.724），见表1。

2.3 CDK6-shRNA 对细胞凋亡能力的影响

本试验采用AnnexinV／PI 双染法流式细胞术检测不同试验组卵巢癌细胞的凋亡情况，为避免操作等因素引起的差异，设3个重复细胞孔，进行凋亡检测。结果显示，shRNA-608 组卵巢癌细胞的凋亡率为（47.63±0.81）%，与shNC 组相比，差异有显著性统计学意义（P ＜0.001），shNC 组和未转染组细胞之间相比，细胞凋亡差异无统计学意义（P ＝0.080），见表2。

3 讨论

目前临床上缺乏卵巢癌有效的早期筛查和诊断方法，多数患者被诊断为卵巢癌时已处于晚期，常以死亡转归。肿瘤细胞减灭术和辅以化疗是卵巢癌治疗的主要方式，但部分患者治疗后出现化疗耐药，病情进一步恶化或者复发，挖掘有效的药物治疗靶点，成为卵巢癌研究的热点。癌症的典型生物学特征是细胞周期紊乱。CDK 是细胞周期关键基因，在肿瘤的发生、发展中具有十分重要的作用。研究发现，CDK6 基因在多种肿瘤中过表达[4-5]。凌晨等发现CDK6 在早期卵巢癌中表达促进了早期卵巢癌发生发展[6]，罗小鹏等发现抑制CDK6 可以明显抑制鼻咽癌细胞增殖能力及细胞周期转化[7]。我们在前期研究中，也发现抑制CDK6 基因后，卵巢癌细胞的增殖和粘附能力也明显受到抑制[3]。本研究发现，靶向抑制卵巢癌细胞CDK6 基因将显著促进细胞凋亡，进一步提示CDK6 可以作为药物靶点的可能性。

表1 各组CDK6 mRNA 的抑制情况

表2 各组卵巢癌HO-8910 细胞凋亡检测结果

利用RNA 干扰技术进行肿瘤治疗已受到极大关注[7-8]。Yan 等通过慢病毒介导的shRNA 方式，成功敲除UHRF1 基因后，HO-8910 细胞的凋亡显著促进、细胞增殖显著受到抑制、肿瘤细胞侵袭能力显著降低[9]。本研究使用shRNA 技术也发现CDK6 基因的抑制显著促进卵巢癌细胞的凋亡。基于CDK6 基因在肿瘤发生、进展过程中的重要作用，一系列CDK 的抑制剂已经完成临床研究，部分抑制剂已上市应用于临床治疗。目前已有多种用于治疗转移性乳腺癌的CDK6 抑制剂通过了美国食品药品管理局（FDA）的批准[10-11]。CDK6 抑制剂通过调控细胞周期，改变肿瘤细胞的微环境，激发抗肿瘤免疫反应等多个机制来有效对抗恶性肿瘤。与同样作用于细胞周期的其他肿瘤抑制剂相比，CDK6 抑制剂在安全性方面具有优势，为恶性肿瘤的治疗带来希望[12]。

综上所述，CDK6 对于肿瘤的发生和发展至关重要，有望作为肿瘤治疗的靶向基因。