柴胡皂苷a抑制PTZ诱导小鼠海马星形胶质细胞增殖和多药转运蛋白的表达*

单 萍，张继龙，笱玉兰，罗利俊

(武汉市第一医院， 武汉 430022)

癫痫是一种常见的神经系统疾病，主要病理表现为神经过度兴奋、神经元异常放电。在我国，癫痫患者人数高达900万，占全球总患病人数的18%，且每年50余万人被确诊为癫痫[1-3]。临床研究数据显示，60%～70%的癫痫患者经过合理的抗癫痫药物治疗后病情可得到有效控制，甚至治疗2～5年后可停药观察[1]。但仍有30%左右的癫痫患者由于对药物不敏感等原因导致治疗效果不佳，发展成为难治性癫痫或耐药性癫痫，直接影响患者的死亡率和致残率，严重干扰患者的生活质量，同时增加患者家庭及社会的经济负担[3]。多药转运体(multidrug transporters，MDTs)蛋白表达的异常可直接影响药物到达作用靶点而导致耐药，是影响癫痫患者治疗效果最为直接的原因之一。有研究[4-5]显示，在难治性癫痫患者体内存在P-糖蛋白(p-glycoprotein，P-gp)等MDTs高表达现象。此外，腺苷激酶(adenosine kinase，ADK)是星形胶质细胞中调节腺苷含量的关键因子之一，ADK活性的异常可引起突触内腺苷含量失衡进而引发癫痫[6]。传统观点认为，癫痫的发作是神经元的异常兴奋所致，但随着癫痫发病机制的深入研究，发现星形胶质细胞功能紊乱和代谢失调参与神经元过度兴奋和癫痫发作，其在癫痫发病中同样发挥着重要作用[7-8]。柴胡皂苷a(saikosaponin a, SSa)是临床常用中药柴胡的主要药理成分柴胡皂苷的单体，具有多种药理功能，如抗癫痫、抗炎、抗惊厥等[9-10]。本研究继续深入研究SSa的抗癫痫作用机制，采用戊四氮(pentylenetetrazole, PTZ)模拟刺激海马星形胶质细胞，探究SSa对PTZ激活小鼠海马星形胶质细胞的干预作用及对MTDs及ADK表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

5只SPF级1～3 d新生C57BL/6小鼠，购自三峡大学实验动物中心，动物许可证号SCXK(鄂)2017-0012，饲养于华中农业大学SPF级动物房，取材当天处死。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM/F-12培养基购自Gibco公司(11320082)；戊四氮(PTZ)购自Sigma公司(P6500);柴胡皂苷a(SSa)购自国药集团化学试剂有限公司(xw080063)；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术公司(C1062)。兔多克隆anti-P-gp抗体(ab170904)、兔多克隆MRP2抗体(ab203397)、兔单克隆BCRP抗体(ab207732)和兔多克隆ADK抗体(ab38010)以及兔二抗(ab6702)购自Abcam公司；兔单克隆GAPDH抗体购自Cell signaling technology公司(2118)。荧光显微镜购自OLYMPUS公司(IX50);酶标仪购自Thermo公司(Multiskan FC，美国);荧光定量PCR仪与凝胶成像系统均购自Bio-Rad公司(CFX-Connect 96，美国);全自动化学发光分析仪购自上海天能科技有限公司(Tanon-5200，中国)。

1.3 小鼠海马星形胶质细胞培养与药物处理

参考Mccarihy法[11]并加以改进后分离培养小鼠海马星形胶质细胞，经免疫荧光鉴定细胞后应用于本实验。采用含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培养小鼠海马星形胶质细胞，并按随机数字表法分为对照组(A组)、10 mmol/L PTZ刺激组(B组)、10 mmol/L PTZ+0.625 mg/L SSa药物组(C组)和10 mmol/L PTZ +1.25 mg/L SSa药物组(D组)。采用无血清DMEM/F-12配制不同药物，B组采用10 mmol/L PTZ处理2 h，C和D组在10 mmol/L PTZ处理之前分别加入0.625 mg/L或1.25 mg/L SSa处理6 h，A组不经过任何处理。分组处理后于荧光显微镜下观察各组细胞形态。

1.4 MTT检测细胞增殖能力

选取生长状态良好的小鼠海马星形胶质细胞，制作单细胞悬液并计数。调整细胞浓度后按照1×104个细胞/孔的标准，接种小鼠海马星形胶质细胞于96孔板内，每组设置3个复孔，置于37 ℃恒温恒湿的培养箱中继续培养48 h。然后采用无血清培养基进行细胞饥饿处理24 h，随后各组细胞进行不同的药物处理，并继续置于培养箱中培养。待药物处理时间结束后，每孔加入20 μL 5% MTT溶液，轻轻混匀后继续置于培养箱中孵育4 h。4 h后取出，2000×g室温离心5 min，小心吸去上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，震荡混匀后采用酶标仪测定540 nm波长处吸光度OD值。按照公式计算细胞增殖率：细胞增殖率=OD实验组/OD对照组×100%。

1.5 Realtime PCR检测相关MTDs及其他相关基因

采用Trizol法提取各组细胞的总RNA，采用逆转录试剂盒反转录合成cDNA，存入-20 ℃保存备用。测定cDNA浓度后稀释浓度至100 ng/μL，用于后续Realtime PCR反应。使用SYBR Green PCR试剂盒检测P-gp、MRP2、BCRP和ADK的转录表达水平，以GAPDH作为内参。P-gp引物：F：5’- CTCATAGTTGCCTACATC-3’，R：5’- ATCTCCTGATTCATTATAGC-3’；MRP2引物：F：5’- ACTGTGCTCACGATTGC-3’，R: 5’- ACTCCCGAACTTCTCCT-3’；BCRP引物：F：5’- GCAGATTCTAAGGTCGGA -3’，R：5’- AGAGGATGGAAGGGTCAG -3’；ADK引物：F：5’- CTCTGAAACCAAATGACC -3’，R：5’- CCCAAACTTATCTATCCC -3’；GAPDH引物：F：5’- CCTTCCGTGTTCCTAC -3’，R：5’- GACAACCTGGTCCTCA -3’，所有引物均由南京金瑞斯生物科技有限公司合成。

1.6 Western blot检测相关蛋白

收集各组细胞沉淀，采用RIPA蛋白裂解液提取细胞总蛋白，并经BCA定量法测定总蛋白溶液的浓度。依据测定的总蛋白浓度，选取20 μg总蛋白配制蛋白上样体系，经SDS-PAGE进行蛋白分离并转移至PVDF膜上。采用5%脱脂牛奶(PBST配制)室温封闭处理1 h，PBST洗膜后加入相应的一抗(P-gp：1∶500；MRP2∶1∶1000；BCRP：1∶1000；ADK：1∶500；GAPDH：1∶1000)置于4 ℃孵育过夜。PBST洗膜3次后依次加入山羊抗兔的二抗，室温孵育1 h后，继续使用PBST洗膜3次，采用ECL显色液进行显色，并采用全自动化学发光分析仪检测信号并成像，采用TANON GIS软件分析蛋白条带的灰度值。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 PTZ对小鼠海马星形胶质细胞形态的影响

图1示，于显微镜下观察小鼠海马星形胶质细胞形态，A组细胞胞质丰富、形态多样，多呈不规则形态；B、C、D组均出现星形细胞，从胞体发出多个突起，细胞核呈圆形或椭圆形，其中D组细胞数量及细胞突起少于B和C组。

注：对照组(A组)、10 mmol/L PTZ刺激组(B组)、10 mmol/L PTZ+0.625 mg/L SSa药物组(C组)、10 mmol/L PTZ +1.25 mg/L SSa药物组(D组)图1 海马星形胶质细胞形态观察比较(200×)

注：对照组(A组)、10 mmol/L PTZ刺激组(B组)、10 mmol/L PTZ+0.625 mg/L SSa药物组(C组)、10 mmol/L PTZ +1.25 mg/L SSa药物组(D组)：aP<0.05 vs A；cP<0.05 vs B；eP<0.05 vs 图3 各组细胞中P-gp、MRP2和BCRP以及ADK mRNA表达水平检测比较

2.2 PTZ对小鼠海马星形胶质细胞的活化作用及SSa的干预作用

图2示，细胞增殖活性检测结果与A组比较，B组细胞增殖率显著升高(P<0.05)，表明PTZ能够促进小鼠海马星形胶质细胞增殖，诱导细胞活化。不同剂量的SSa药物组(C和D组)细胞增殖率较PTZ刺激组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，且高剂量的D组作用效果更加明显。这些数据表明，SSa能够抑制PTZ诱导小鼠海马星形胶质细胞的异常活化，且具有剂量依赖性。

注：对照组(A组)、10 mmol/L PTZ刺激组(B组)、10 mmol/L PTZ+0.625 mg/L SSa药物组(C组)、10 mmol/L PTZ +1.25 mg/L SSa药物组(D组)；aP<0.05 vs A；cP<0.05 vs B；eP<0.05 vs C图2 MTT检测细胞增殖活性比较

2.3 SSa对PTZ激活小鼠海马星形胶质细胞中MDTs和ADK mRNA表达的影响

图3示，与A组比较，B组细胞中P-gp、MRP2和BCRP以及ADK的mRNA均显著性上调(P均<0.05)；与B组比较，C和D组细胞中P-gp、MRP2和BCRP以及ADK mRNA表达水平显著下调(P均<0.05)，且随SSa剂量增加各指标的mRNA表达水平降低。结果表明，PTZ能够诱导小鼠海马星形胶质细胞中MDTs和ADK mRNA表达水平上调，SSa药物处理可抑制PTZ的这一作用。

2.4 SSa对PTZ激活小鼠海马星形胶质细胞中MDTs和ADK蛋白表达的影响

图4示，进一步检测各组细胞中P-gp、MRP2和BCRP以及ADK蛋白表达水平，与A组比较发现，B组细胞中P-gp、MRP2、BCRP以及ADK蛋白表达水平均急剧增加，与对照组比较差异有统计学意义(P均<0.05)；与PTZ刺激组(B组)比较，两个SSa药物组(C和D组)细胞中P-gp、MRP2、BCRP以及ADK蛋白表达水平均显著下调(P均<0.05)。结果表明，SSa可抑制PTZ诱导的P-gp、MRP2、BCRP以及ADK蛋白表达的上调。

注：对照组(A组)、10 mmol/L PTZ刺激组(B组)、10 mmol/L PTZ+0.625 mg/L SSa药物组(C组)、10 mmol/L PTZ +1.25 mg/L SSa药物组(D组)；aP<0.05 vs A；cP<0.05 vs B；eP<0.05 vs C图4 各组细胞中P-gp、MRP2和BCRP以及ADK蛋白表达水平检测比较

3 讨论

正常情况下，星形胶质细胞发挥着机体保护作用，可为神经元提供营养，同时也可有效清除兴奋性神经递质谷氨酸[2, 12]。然而长期慢性癫痫发作可诱导星形胶质细胞活化，引发海马硬化，同时还可产生和释放神经营养因子等促使癫痫发作[11-12]。本研究数据也证实了这一观点，常用慢性癫痫诱导药物PTZ刺激小鼠海马星形胶质细胞后可诱导细胞增殖，促使细胞活化。

尽管对癫痫的治疗已取得一定成效，但难治性癫痫因易产生耐药性其治疗效果不甚理想。针对难治性癫痫的耐药机制，目前存在2种假说，其中一种假说认为药物作用靶点发生改变，从而降低了对抗癫痫药物的敏感性[13-14]；另一假说转运蛋白假说认为，MTDs的表达或功能在大脑中得到增强，可阻碍抗癫痫药物通过血脑屏障到达脑部病灶部位，从而抑制抗癫痫药物对中枢神经系统的作用，影响药物疗效[13, 15]。MTDs是一类跨膜蛋白，能够利用ATP水解产生的能量，逆浓度梯度运输药物或底物[16]。研究发现，多种MTDs(如P-gp、MRP1/2)等在难治性癫痫患者脑组织或免疫细胞中过度表达[17-19]。本课题组前期研究也发现，PTZ诱导慢性癫痫小鼠脑海马组织中P-gp蛋白表达水平上调[20]。此外，半转运蛋白乳腺癌耐药蛋白(Breast cancer resistance protein, BCRP)同样参与血脑屏障中药物的转运，且在血脑屏障上呈现高表达的状态，阻止药物等底物进入大脑，其在药物通过血脑屏障过程中与P-gp发挥协同屏障的作用[21]。Wang等[22]研究发现，活化的星形胶质细胞中P-gp和MRP1表达上调，因此推测高表达MTDs的活化星形胶质细胞可能参与癫痫耐药过程。本研究数据也显示，PTZ组海马星形胶质细胞中P-gp、MRP2以及BCRP表达水平均高于对照组，表明星形胶质细胞中P-gp、MRP2以及BCRP等MTD蛋白表达异常与癫痫的耐药性具有紧密的相关性。

柴胡总皂苷是中草药柴胡的主要成分，依据其化学结构的不同可分为多种单体，其中SSa和柴胡皂苷d(SSd)是柴胡皂苷的有效成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗癫痫等多种作用。研究发现，SSa可显著抑制PTZ点燃癫痫发作的时间及严重程度，延长癫痫发作的潜伏期[23]。在PTZ诱导的慢性癫痫大鼠和氯化锂-匹罗卡诱导的难治性癫痫大鼠中，SSa均发挥了明显的抗癫痫作用，促进星形胶质细胞对谷氨酸的清除，降低海马中P-gp蛋白表达水平[24-25]。本研究数据发现，在海马星形胶质细胞中，SSa能够抑制细胞的活化与增殖，显著抑制PTZ诱导的MTDs表达，提示SSa对海马星形胶质细胞活化、增殖及耐药的影响可能与其抗癫痫作用密切相关。腺苷是脑组织中广泛存在的抑制性神经递质，可有效降低神经兴奋性。但癫痫发生时，星形胶质细胞中ADK可有效清除细胞内腺苷，造成胞外腺苷浓度降低。由此可见，ADK的表达上调可影响腺苷含量水平，进而引发癫痫[6]。在本次研究结果中，SSa对PTZ诱导海马星形胶质细胞ADK表达增加具有明显的抑制作用，进一步说明SSa通过对海马星形胶质细胞产生影响，进而发挥癫痫治疗作用。

综上所述，本研究数据显示，SSa可有效抑制PTZ诱导海马星形胶质细胞的活化与增殖，同时降低细胞中多种MTDs以及ADK的表达。提示SSa可能通过逆转多药转运蛋白的表达水平，降低难治性癫痫患者的耐药性，增加患者的治疗疗效，这将为SSa应用于临床治疗难治性癫痫提供理论依据。