花青素对大肠埃希菌生物膜的作用及其机制研究

俞容，俞北伟

（1.金华市人民医院，浙江 金华 321000；2.杭州市江干区人民医院，浙江 杭州 310016）

大肠埃希菌（Escherichia coli）是胃肠外感染的常见原因，包括尿路感染、新生儿脑膜炎、菌血症和前列腺炎等，免疫功能不全的患者易感染[1]、碳青霉烯类药物是治疗的主要药物之一。随着临床上的广泛使用，出现了耐碳青霉烯的大肠埃希菌（Carbapenem-resistant E.coli，CREC）， 给抗感染治疗带来了新的挑战[2]。此外，大肠埃希菌可以在物体表面（如：医疗器械等）形成生物膜，增加了治疗难度[3]。因此，迫切需要寻找新的药物解决这一问题。花青素（Cyanidin）属于酚类化合物中的类黄酮类，有研究证实，花青素对肺炎克雷伯菌生物膜的形成有抑制作用，而对CREC的作用仍未知[4]。本研究旨在通过分析花青素降低CREC生物膜的作用及其机制，为控制CREC引起的难治性感染提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 3株CREC菌株（EC1，EC2和EC3）分离自2019年金华市人民医院住院患者尿液标本；质控菌株大肠埃希菌ATCC25922（EC25922）购自卫生部临床检验中心；亚胺培南和美罗培南（大连美仑生物技术有限公司）；MH平板（南京一基生化科技有限公司）；MH肉汤 （英国Oxoid公司）；96孔板（美国康宁公司）；花青素（吉林隆泽生物工程有限责任公司）；荧光定量PCR仪（美国Thermo公司）；1%结晶紫（美国Thermo公司）；实时荧光定量PCR试剂盒（日本TOYOBO公司）；PBS、戊二醛和无水乙醇 （上海生物工程股份有限公司）；比浊仪（法国梅里埃公司）；可见分光光度计（上海精科公司）。

1.2 方法

1.2.1 药物敏感性试验 使用琼脂稀释法对三株CREC和质控菌株EC25922对两种常用碳青霉烯类药物（亚胺培南和美罗培南）的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentrations，MIC） 进行测定。结果根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）2019标准判读。

1.2.2 生长能力测定 将3株CREC和EC25922接种到MH平板上，37℃静置过夜培养。挑取单菌落于10mL MH肉汤中，37℃、200rpm条件下过夜培养，次日进行1:100比例稀释，以同样条件进行亚培养，同时加入80μg/mL花青素的培养管为对照，每隔2小时测定吸光度值（OD600）。

1.2.3 生物膜形成能力检测 96孔板结晶紫染色法行细菌生物膜形成能力测定[5]。细菌过夜培养后挑取单菌落于10mL MH肉汤中，在37℃、180rpm条件下过夜培养。次日吸取100μL菌液至10mL MH肉汤中，吸取10μL稀释后菌液加入含190μL MH肉汤的96孔板中。不加菌液的200μL MH肉汤作为空白对照，以加入80μg/mL花青素的培养管为对照，同时做10个复孔。培养24小时后弃去浮游细菌，PBS洗2次。待干燥后加入200μL结晶紫染色10分钟。弃去染液，加入250μL无水乙醇，静置10分钟。吸取100μL测定吸光度OD600，计算10个复孔的平均值。

1.2.4 生物膜结构观察 选取生物膜形成能力最强的EC1进行试验，单菌落培养后调至0.5麦氏浊度，1:100稀释菌液，将不锈钢片放入6孔板中，每孔加入菌液2mL，37℃培养2小时。以加入80μg/mL花青素的培养管为对照。生物膜形成后弃培养液，PBS洗3次，风干。加入2mL 2.5%的戊二醛，之后用梯度浓度（50%、70%、80%、90%和100%）无水乙醇分别脱水10分钟，干燥后镀金，电子显微镜扫描观察。

1.2.5 生物膜形成相关基因表达量的检测 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测生物膜形成相关基因的表达量。在含或不含80μg/mL花青素的条件下，通过qRT-PCR检测生物膜相关基因（fim，luxS和pgaA）的表达量。引物参照文献进行合成[6]，详见表1。采用2-ΔΔct方法计算生物膜形成相关基因的表达量。大肠埃希菌EC25922为对照菌株，16S rRNA为内参基因。

1.3 统计学处理 应用GraphPad Prism 6.0对数据进行图片绘制和统计学分析，生物膜形成和基因表达量之间的差异采用t检验。

表1 qRT-PCR引物序列

2 结果

2.1 药物敏感性 EC1、EC2、EC3对临床上常用的亚胺培南和美罗培南均耐药，MIC≥64 μg/mL，而EC25922对两种药物均敏感，对亚胺培南和美罗培南的MIC分别为0.3μg/mL和0.15μg/mL。详见表2。

表2 4株大肠埃希菌药敏结果（μg/mL）

2.2 生长能力 EC1、EC2、EC3在未含有 80μg/mL花青素的条件下均生长良好，大约12小时达到稳定期。加入80μg/mL花青素后大肠埃希菌生长均受到抑制，OD600值下降强度为2-3。详见表3、图 1。

2.3 生物膜形成能力 在无80μg/mL花青素的环境下，大肠埃希菌生物膜形成能力较强；加入80μg/mL花青素后，细菌形成的生物膜量减少，下降强度为1.5左右。EC1、EC2及EC3加入80μg/mL花青素前后比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。详见表 4、图 2。

2.4 生物膜结构分析 电镜结果显示，在无80μg/mL花青素的环境下，细菌生长良好，细菌之间相互聚集成簇，遍布整个视野（图3A）；加入80μg/mL花青素后，细菌形成的生物膜量明显减少，细菌散落分布于视野中（图3B）。

表3 不同时间花青素对4株大肠埃希菌生长能力的影响

图1 花青素对4株大肠埃希菌生长能力的影响。1A：EC1与EC1#的比较；1B：EC2与EC2#的比较；1C：EC3 与 EC3#的比较；1D：EC25922 与 EC125922#的比较。

表4 花青素作用前后大肠埃希菌生物膜形成能力

图2 花青素对大肠埃希菌生物膜形成能力的影响

2.5 生物膜相关基因表达量 加入80μg/mL花青素组和未加入组相比，群体感应相关基因luxS的表达量明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与大肠埃希菌菌毛相关基因fim以及与细胞外聚多糖形成有关的基因pgaA的表达无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。 详见表 5、图 4。

图3 电镜下花青素对大肠埃希菌生物膜结构的影响。3A：无80μg/mL花青素的环境下；3B：加入80μg/mL花青素处理后。

表5 花青素对生物膜形成相关基因表达量影响

图4 花青素对生物膜形成相关基因表达量的影响

3 讨论

尿路感染作为人类最常见的感染之一其90%由革兰阴性菌引起的，其中80%～90%是由大肠埃希菌引起[7-8]。由于病原体对常用的抗菌药物（包括氟喹诺酮类和头孢菌素类）具有耐药性[9]，对这些感染的治疗越来越棘手。此外，大肠埃希菌可以在医疗器械上形成生物膜，使感染的治疗与控制更加困难[10]。因此，研究人员逐渐将目光转移到对细菌生物膜有抑制作用的物质和成分上，比如花青素。刘艺清等[11]通过体外生物膜研究以及RNA测序发现高浓度的花青素对铜绿假单胞菌的涌动有抑制作用；Gopu等[4]发现花青素对肺炎克雷伯菌生物膜的形成有一定的抑制作用。此外，Pejine等[12]研究发现，花青素对铜绿假单胞菌PAO1有一定的抗生物膜以及抗群体感应的活性，进一步表明了此化合物可以作为一种新的抗菌策略。

本研究选取了3株分离自尿液的大肠埃希菌，并以敏感菌株EC25922作为对照。结果发现，花青素对3株CREC以及敏感菌株EC25922的生长能力都有一定的抑制作用。96孔板结晶紫染色法检测了在有/无花青素条件下细菌的生物膜形成能力，结果显示，花青素可以降低大肠埃希菌的生物膜形成能力。根据上述结果初步推断：花青素降低生物膜的作用可能是因为花青素抑制其生长，使细菌的总量相应减少，粘附到96孔板上的细菌将相继减少。作者进一步通过电子显微镜扫描观察，结果发现，细菌不再聚集成簇，散落分布于视野中证实了花青素可以显著降低大肠埃希菌生物膜的总量。

为了从基因表达的角度分析花青素抑制大肠埃希菌生物膜形成的机制，作者对生物膜形成相关基因的表达水平进行了检测。结果显示，花青素不能降低与大肠埃希菌菌毛相关基因fim以及与细胞外聚多糖形成有关的基因pgaA的表达水平；然而，与群体感应密切相关的基因luxS的表达水平明显降低。因此，花青素可以降低luxS的表达量，进一步降低细菌之间交流需要的信号，使细菌与细菌之间生物膜形成量减少。

综上所述，花青素主要通过降低群体感应功能相关基因luxS的表达量，抑制大肠埃希菌的生物膜形成，为临床控制由CREC引起的感染提供一定的理论依据。