酸蚀对乳牙玻璃离子窝沟封闭微渗漏和微拉伸强度的比较研究

武 洁，刘 茜，陈央兰，周红艳，梅予锋

我国儿童乳牙龋齿患病率居高不下，已成为严重的公共卫生问题，可导致患儿疼痛、咀嚼进食能力下降、睡眠障碍、注意力不集中、生活质量下降等问题。严重龋齿可能导致儿童体质量减轻，生长迟缓，影响儿童的成长和发育[1]。

窝沟封闭剂已被证明是预防窝沟龋的有效方法[2]，封闭剂的物理屏障作用，可以防止口腔细菌和饮食碳水化合物在牙齿的窝沟点隙内聚集，形成酸性环境，导致牙齿结构的破坏。由于树脂封闭剂操作过程需要完全隔湿，但是儿童口腔隔湿困难，尤其是欠合作儿童，因此玻璃离子封闭剂可以为儿童提供更好的替代办法[3]，其缓慢释放氟离子的特性有助于发挥对窝沟和光滑面防龋作用，并且可以促进早期龋的再矿化[4-5]。有文献报道酸蚀可提高玻璃离子与牙釉质微拉伸强度[6]，本实验通过对酸蚀与配套液体为处理剂两种不同釉质处理方法，观察乳牙玻璃离子窝沟封闭微渗漏和微拉伸强度的影响，为临床开展儿童窝沟封闭防龋提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与主要实验仪器

1.1.1 窝沟封闭材料 Ketac®Molar Easymix 玻璃离子粉套装(3M ESPE公司，美国)；35% 釉质酸蚀剂(GLUMA公司，德国)；1% 亚甲蓝溶液(雷根生物，中国)。

1.1.2 实验仪器 体视显微镜(Nicon，SM10000，日本)；微拉伸测试仪(BISCO，MECMESIN,英国)；冷热循坏仪(威尔，Tc-501F，中国)；医用硬组织切片机(BUEHLER，ISOMET，德国)；电子显微镜(东芝，SU3500，日本)。

1.1.3 样本选择 收集临床拔除滞留，无龋、窝沟点隙深[7]、冠部完整的第二乳磨牙共24颗，其中微渗漏、微拉伸实验各10颗，电镜实验4颗。清洗后置入4 ℃生理盐水中保存备用。

1.2 方法

1.2.1 窝沟封闭 10颗离体保存的第二乳磨牙，酸蚀组和处理剂组每组各5颗。两组均遵循ART窝沟封闭程序操作[7]。①牙面处理，先用小毛刷低速清理窝沟表面10 s，三用枪吹干，酸蚀组采用35%磷酸酸蚀剂处理牙面窝沟40 s，然后三用枪冲洗10 s去除酸蚀剂，吹干。处理剂组仅用小棉球蘸Ketac®Molar Easymix 玻璃离子配套液体涂擦窝沟表面约15 s，然后用湿棉球擦干，避免过度干燥。②放置窝沟封闭剂，在戴手套的食指上涂上少量的凡士林，采用“指压法”用食指将搅拌好的封闭剂压入窝沟中，轻轻加力10～15 s后将手指侧移。③待凝固后去除多余封闭剂。

1.2.2 微渗漏样本制备 两组样本冷热循环(4 ℃，37 ℃) 500次[8]，每个温度停留30 s。之后将标本取出吹干，每组5个标本进行微渗漏实验，采取浸蜡法封闭根尖孔及根方侧支根管，并在距封闭剂边缘1 mm外的牙冠均匀涂布两层指甲油，晾干后把样本在37 ℃ 1%亚甲蓝溶液中浸泡24 h，蒸馏水彻底冲洗标本残留的染料，截根，固定医用硬组织切割机上，沿中央沟及近、远中点隙3点连线相应的位置片切标本，每个标本得到2个剖面，共计20个剖面。

1.2.3 微渗漏测定 采用单盲法，由两位进行过标准一致性检验的检查者在体视显微镜( ×30)下，对每个切片进行检测，并采用0～4五级计分[9](图1)。微渗漏指数计分：0=无染色渗透；1=近中或远中的一侧窝沟壁染色渗透；2=近中和远中侧窝沟壁均染色渗透；3=近中和远中侧窝沟壁封闭剂下方染色渗透；4=整个封闭剂周围均染色渗透。每个切片经过2位评估者共2次评分，以2个评分中的最高分记录。

A：微渗漏计分1；B:微渗漏计分2；C:微渗漏计分3；D:微渗漏计分4图1 微渗漏计分Fig.1 The grade scale of micro-leakage score

1.2.4 微拉伸实验 将10颗离体牙平牙颈部截取牙冠,取平坦的颊面釉质约5 mm×5 mm，800 目碳化硅砂纸打磨40 s，将内径3 mm、高5 mm的圆柱形模具垂直置于制备好的牙面上,用蜡封闭模具边缘。离体牙随机分成2组，每组5颗。酸蚀组：35%磷酸酸蚀40 s，冲洗20 s,彻底干燥；处理剂组：采用配套的液体涂擦牙面，气枪轻吹10 s。两组样本表面处理后，均填入调拌好Ketac®Molar Easymix玻璃离子，指压固化后取下模具，每个受试釉质面上形成一个窝沟封闭剂小柱。样本再经硬组织切割机切成1 mm×1 mm×10 mm试件,封闭剂小柱与牙齿各5 mm长。每个样本得到2个完整试件。

1.2.5 微拉伸测定 用游标卡尺测量每个试件粘结面的实际面积，再将试件用ZAPIT胶固定于微拉伸仪上检测其拉伸粘结强度，加载速度为0.5 mm/min，直至窝沟封闭剂与牙面断裂,记录每个试件的微拉伸粘结强度。每颗牙齿的拉伸粘结强度取其两个小试件的平均值。计算公式：微拉伸粘结强度(N/mm2)=断裂时最大载荷/粘结面积。

1.2.6 扫描电镜观察 选取4颗离体第二乳磨牙，随机分酸蚀和处理剂处理两组。每组各取1颗并按以上方法进行窝沟封闭后标本，用慢速金刚砂片截除牙根，并用硬组织切割机，沿近、远中窝沟片切样本，水磨砂纸抛光，冲洗，干燥，固定于样品台上，喷金镀膜，用扫描电镜观察窝沟封闭剂与牙面结合情况，采用Image-Pro Plus 6.0图形处理软件，对1 000、2 000倍电镜照片测量封闭材料与釉质之间的微间隙(μm)，取两侧窝沟壁，每侧从小到大取5个测量点，每组10个测量点。余下每组各1个样本不做窝沟封闭，仅用扫描电镜观察牙合面窝沟表面釉质经不同方法处理后的结构变化。

1.3 统计学处理

实验数据采用SPSS 21.0统计软件对资料作整理与分析，微渗漏两组间的测试数据比较采用Mann-WhitneyU秩和检验，微拉伸两组间的测试数据比较采用t检验，所有检验水平均设为ɑ=0.05 。

2 结 果

2.1 微渗漏情况比较

两位观察者对各组微渗漏评分经Kappa一致性检验，Kappa值为0.79，显示两者一致性优。酸蚀组微渗漏评分低于处理剂组，经Mann-WhitneyU秩和检验两组间有显著性差异，Z=2.50，P=0.012，见表1。

表1 酸蚀与处理剂两组乳磨牙微渗漏计分比较Tab.1 Distribution of micro-leakage between two groups with acid etching and liquid in primary molars

2.2 微拉伸情况比较

酸蚀组微拉伸结合强度高于处理剂组，有显著性差异(P<0.05)，见表2。

表2 酸蚀与处理剂两组乳磨牙微拉伸强度比较Tab.2 Comparison of microtensile bond strength between two groups with acid etching and liquid in primary molars

2.3 扫描电镜观察

2.3.1 酸蚀与处理剂两组乳磨牙电镜照片 乳磨牙牙合面、剖面釉质酸蚀和液体处理后的电镜照片见图2～3。

2.3.2 电镜照片图形软件测量 结果显示酸蚀组微间隙宽度为(0.90±0.25)μm，处理剂组为(1.90 ± 0.65)μm，经统计学处理t=4.97，P<0.01，有显著性差异(图4)。

A：酸蚀组为柱间质脱矿，釉质呈典型蚀刻结构；B：处理剂组为釉质表面粗超呈细小的蜂窝微孔结构图2 乳磨牙牙合面釉质酸蚀和液体处理后电镜照片比较( ×1 000)Fig.2 SEM images of occlusions of primary second molars with acid-etched and liquid-conditioned enamel( ×1 000)

A：酸蚀组乳磨牙剖面显示玻璃离子封闭材料与窝沟壁结合部位有细小断续的缝隙( ×50)；B: 处理剂组乳磨牙剖面显示玻璃离子封闭材料与窝沟壁结合部位细小断续的缝隙( ×50)；C: 酸蚀处理后玻璃离子封闭材料与窝沟壁结合部位断续的嵌合层、窄的缝隙( ×2 000)；D：处理剂组处理后乳磨牙剖面显示玻璃离子封闭材料与窝沟壁结合部位少量嵌合点、宽而长的缝隙( ×2 000)图3 乳磨牙剖面釉质酸蚀和液体处理后电镜照片Fig.3 Cross-section SEM images at interfaces of the enamel-GIC sealants

图4 两组封闭材料与窝沟微间隙比较Fig.4 Micro-fractures were measured at interfaces of the enamel-GIC sealants

3 讨 论

窝沟点隙部位患龋风险是光滑面的8倍[10]，学龄儿童约50%的龋齿位于咬合面[11]。Gawali等[12]报道儿童第二乳磨牙最容易发生窝沟龋齿。江苏省3～5岁儿童龋病流行病学抽样调查报告[13]显示：乳牙患龋水平居高不下，且呈现上升趋势，5岁儿童患龋率和龋均分别为71.43%和4.05。幼儿患龋情况不容乐观，应重点针对这一高危人群进行防治[14]。因此，开展窝沟龋的预防具有十分重要的意义。

美国牙医学会(ADA)发布的以循证为基础的窝沟封闭指南指出窝沟封闭在预防和阻止儿童和青少年乳、恒磨牙的牙合面龋是有效的，是综合防龋措施的一项重要部分，推荐在一级预防和二级预防对早期龋干预措施时采用窝沟封闭。由于证据有限，无法确定树脂、玻璃离子、聚酸改性树脂、树脂改性玻璃离子类窝沟封闭剂哪一类更优[15]。Prathibha等[16]临床研究报道，树脂基质封闭剂保留率优于玻璃离子封闭剂，在防龋方面没有取得显著的结果。玻璃离子水门汀具有良好的生物相容性、生物活性，能释放氟，与牙体组织的粘附性好，即使在潮湿的条件下也易于处理，非常适合儿童使用，也是在儿牙和修复治疗中广泛应用的原因[17-18]。

ART封闭技术(ART sealants)是指应用高粘度玻璃离子如Ketac Molar Easy Mix(3M ESPE)和Fuji IX(GC)等[19]，在临床操作时通过ART指压技术将封闭剂填压入窝沟点隙，加深渗入深度，提高材料保留率，窝沟封闭剂预防窝沟龋的能力与封闭剂的保留及其起到物理屏障作用密切[20]。树脂类窝沟封闭需要对牙合面酸蚀[15]，清洗后去除釉质表面溶解的矿物质，形成微孔，有利于封闭剂材料在窝沟中的渗透[21]。较早时建议对乳牙的酸蚀时间比恒牙长一倍，有研究使用不同的酸蚀时间对封闭剂的保留没有明显差异，从儿童合作来考虑，酸蚀时间越短唾液污染的概率越低[19]，通常建议恒牙20～30 s，乳牙30～60 s[22]，本文实验采用酸蚀时间为40 s。

Liu等[23]24个月的临床研究结果，ART玻璃离子窝沟封闭部分和完全脱落率高于树脂类封闭剂。我们分析认为，ART封闭术与ART充填术高粘度玻璃离子材料的放置部位不同，ART封闭术放置位置是无机成分高于牙本质的牙釉质，采用的配套液体为牙本质处理剂[18]，用于牙釉质表面处理，因其成分为10%的弱酸类聚丙烯酸[16]，处理10 s不能对窝沟釉质表面微结构产生足够的影响，如果在ART封闭方案中增加磷酸酸蚀技术，与采用树脂基类窝沟封闭材料相比较，虽然需要酸蚀、粘结系统，增加光固化设备和操作时间，但其成本低，可提高玻璃离子封闭材料在窝沟表面的保留率，取得更好的防龋效果。本文实验结果，酸蚀组微渗漏评分明显低于液体组，微拉伸强度明显高于液体组，均有显著性差异(P<0.05)，酸蚀组封闭剂与窝沟壁之间微间隙宽度明显小于处理液组(P<0.01)。以上结果提示我们改进传统ART封闭方案，采用酸蚀处理窝沟表面釉质，产生微孔结构，有利于封闭材料的渗入，增强与窝沟的结合与固位力。

Zhang等[6]报告采用酸蚀处理能显著提高Ketac®Molar Easymix, Fuji Ⅰ玻璃离子和树脂改性玻璃离子与牛牙釉质微拉伸强度(P<0.05)。电镜研究观察酸蚀后釉质表面出现典型的蚀刻模式，玻璃离子突延伸渗入釉质，在界面之间形成厚的嵌合层(hybrid layer)。使用配套玻璃离子液体处理釉质表面后，去除了玷污层，釉柱间质溶解，但没有出现典型的蚀刻模式[6]，说明酸蚀处理改变釉质表面微结构，形成密集的微孔结构增加了封闭材料渗入釉质，扩大了接触面和深度形成嵌合层。本文实验电镜观察结果：①酸蚀处理后乳磨牙牙合面高倍电镜照片显示釉质表面釉柱间质脱矿，呈现典型蚀刻结构，液体处理后样本表面玷污层清除，粗糙呈细小的蜂窝微孔结构。②两组低倍电镜照片封闭剂均填满窝沟，可见封闭剂与窝沟壁之间细小、断续的缝隙。③酸蚀处理后高倍电镜照片观察到玻璃离子封闭材料与釉质之间长的嵌合层片段和断续、窄的缝隙。处理剂组电镜照片玻璃离子封闭材料与釉质结合部位仅少量嵌合点、缝隙宽而长，提示釉质酸蚀后形成的微孔结构加上指压技术[24]，有助于高粘性玻璃离子封闭剂的与釉质微孔结构产生嵌合增加微机械固位力，酸蚀组微拉伸强度显著高于处理剂组(P<0.05)。

玻璃离子封闭剂能缓慢释放氟化物和矿物离子到牙齿最容易患龋的部位，当玻璃离子流失时，部分材料仍存留在窝沟深处，以提供机械保护，并持续释氟[3]。高粘度玻璃离子表现出更高的初期和持续的氟释放作用[25]。Feroz等[26-27]体外研究报告，GC Fuji Ⅰ和3M Ketac Molar两种玻璃离子材料能有效降低变形练球菌的菌落计数，抑制和杀灭变形链球菌效果最好。

一项乳磨牙窝沟封闭的临床观察中，实验组采用35%磷酸酸蚀处理乳磨牙牙合面，对照组采用玻璃离子配套的液体处理乳磨牙牙合面，观察12个月后酸蚀组封闭剂保留情况优于处理液组，患龋情况显著低于处理液组(P<0.05)[28]，本文实验结果也提示，酸蚀后在釉质表面形成的微孔结构，有利于玻璃离子进入，增加与釉质结构的嵌合,显著减少微渗漏，增强微拉伸力，可以提高封闭剂的保留率和防龋效果。