一株鸭源巴氏杆菌的分离及荚膜抗原血清型鉴定

贾仰波

(山东省博兴县畜牧兽医局山东滨州 256500)

鸭巴氏杆菌病又称鸭霍乱，是由禽多杀性巴氏杆菌引起的一种急性、败血性、高度接触性传染病，该病主要引起禽类出血性败血症，发病急、死亡快。多杀性巴氏杆菌根据荚膜抗原可以分为A、B、D、E、F 等5 种血清型，且不同血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护力，通常我国家禽中主要流行A 型多杀性巴氏杆菌。2018 年5 月某鸭场270 日龄的产蛋鸭突然出现大规模死亡情况，未死病鸭多精神沉郁、呼吸困难、食欲废绝、排黄绿色稀粪，急性病死鸭没有明显的临床症状，发病率约21%，死亡率高达40%。对病死鸭进行剖检有明显的败血症症状，肝脏肿大、质脆，表面有大量针尖大小的灰白色坏死点，心包膜增厚、有积液，各段肠黏膜弥漫性出血，脾脏肿大出血等。本文从这例典型的鸭巴氏杆菌病中分离一株鸭源荚膜血清型为A 型的巴氏杆菌并对其进行鉴定，可为临床诊断和治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源病死鸭来自山东某鸭场，无菌采集心脏、肝脏作为病料。

1.1.2 培养基及试剂培养基胰酪大豆胨琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、新生牛血清等，均购自武汉洁洋盛科技有限公司；革兰氏染色试剂，购自北京索莱宝科技有限公司产品；药敏纸片和微量生化试管，购自杭州微生物试剂有限公司；2×Taq PCR Mix、DL2000 DNA Marker 均购自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 PCR 引物根据禽多杀性巴氏杆菌特异基因设计PCR 引物。鉴定引物序列如下，P1：5'-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3'，P2:5'-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3'，目的片段为457bp；荚膜血清型A、B、D、E、F 特异性基因引物序列如下，A1：5'-TGCCAAAATCGCAGTCAG-3'，A2：5'-TTGCCATCATTGTCAGTG-3'，目的片段为1044bp；B1：5'-CATTTATCCAAGCTCCACC-3'，B2：5'-GCCCGAGAGTTTCAATCC-3'，目的片段为760bp；D1：5'-TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC-3'，D2：5'-CATCTACCCACTCAACCATATCAG-3'，目的片段为657bp；E1：5'-TCCGCAGAAAATTATTGACTC-3'，E2：5'-GCTTGCTCTTGATTTTG TC-3'，目的片段为 511bp；F1：5'-AATCGGAGAACGCAGAAATCAG-3'，F2：5'-TTCCGCCGTCAATTACTCTG-3'，目的片段为851bp。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离无菌环境下将采集的心脏、肝脏等病料接种到2%新生牛血清胰酪大豆胨琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基平板上，37℃恒温培养24h，观察菌落形态，挑取典型单菌落进行革兰氏染色、镜检，同时划线接种于含2%新生牛血清TSA 平板纯化培养。

1.2.2 生化试验按常规方法进行生化试验，将纯化的病原菌分别接种于各微量生化发酵管内，37℃培养24～48h，观察反应结果。

1.2.3 PCR 鉴定 将纯化分离菌煮沸10min，10,000rpm 离心5min，取上清液作为PCR 模板；鉴定PCR 体系为：2× Taq PCR Mix 10μL、上下游引物各0.5μL、模板1μL，补ddH2O 至20μL，同时设立阴阳性对照，阳性对照选用标准株C48-2 株（CVCC44802）；反应条件为95℃预变性5min，95℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸40s，30 个循环，最后72℃延伸10min；分型使用多重PCR 方法，反应体系和条件与鉴定PCR 一致。PCR 反应结束后用1%的琼脂糖凝胶板电泳，并用凝胶成像仪进行成像分析。

1.2.4 药敏试验采用纸片扩散（K-B）法进行分离菌的药敏试验。选用15 种药敏纸片：大观霉素、诺氟沙星、头孢曲松、四环素、阿米卡星、阿奇霉素、新霉素、林可霉素、克林霉素、链霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、多黏菌素B、磺胺异噁唑、多西环素，37℃培养24h后观察测量抑菌圈的直径，按照抗微生物药物敏感性试验执行标准（CLSI）进行敏感性分析。

2 结果

2.1 细菌分离

在2%新生牛血清胰酪大豆胨琼脂培养基上可见有圆形、灰白色、边缘整齐、湿润似露珠样的大小不一菌落，革兰氏染色镜检为革兰氏阴性短杆菌；而在麦康凯平板上无菌生长。

2.2 生化试验

生化鉴定结果显示该分离株能够发酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、甘露醇，不发酵麦芽糖、乳糖、棉子糖、鼠李糖，脲酶试验、甲基红和V-P 试验阴性，接触酶试验、吲哚试验为阳性，与多杀性巴氏杆菌的生化特征相似。

2.3 PCR 鉴定

鉴定PCR 产物在457bp 处得到预期的目的条带。A、B、D、E、F 荚膜血清型分型PCR 检测只扩增出了大小约1000bp 的目的条带，与荚膜血清A 型特异性基因预期大小一致。由此根据临床症状、剖检变化、菌株的形态特征、生化特性及PCR 鉴定分型结果，确定该分离株为鸭源荚膜血清A 型多杀性巴氏杆菌。

2.4 药敏试验

药敏结果表明该分离菌呈多重耐药，对大观霉素、多黏菌素B中度敏感，对头孢曲松低敏，对诺氟沙星、四环素、阿米卡星、阿奇霉素、新霉素、林可霉素、克林霉素、链霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、磺胺异噁唑、多西环素耐药。

3 讨论

鸭巴氏杆菌病是当前严重危害养鸭业的重要细菌性传染病之一，急性型发病率和死亡率可高达80%～90%，尤其产蛋鸭更易感染发病。经了解该养殖场没有及时免疫接种巴氏杆菌疫苗，加之发病前期气候突然变化等应激因素影响，导致了此次鸭巴氏杆菌病的发生。加强饲养管理，正确免疫仍是控制鸭巴氏杆菌病的主要措施，利用禽巴氏杆菌病蜂胶灭活疫苗可以起到很好的预防效果。■