超高效液相色谱法测定烟草中顺-冷杉醇

付秋娟，杜咏梅，王爱华，刘艳华，韩 晓，张晓敬

中国农业科学院烟草研究所，山东省青岛市崂山区科苑经四路11 号 266101

冷杉醇属于赖百当类萜醇，广泛存在于冷杉油树脂尤其是香脂冷杉［Abies balsamea（L.）Mill.］中［1］。目前报道的冷杉醇均为顺-冷杉醇，自然界还未见有关反-冷杉醇存在的报道［1-2］。烟草赖百当类萜醇最早由Giles 等［3］从陈化的土耳其香料烟中分离得到，其中，顺-冷杉醇为烟草主要的赖百当类萜醇。顺-冷杉醇与西柏三烯二醇、糖酯均为烟草表面腺毛分泌物的主要成分，是烟草香气成分的重要前体物质［4-6］。烟叶在调制、醇化过程中，顺-冷杉醇会降解转化为降龙涎香醚、龙涎香内酯等具有令人愉快的龙涎香香气的物质［4-5］。另外，有研究表明，顺-冷杉醇在烟草抗虫、抗病和抵御其他微生物侵染过程中也起着重要作用［2,7-9］。早期的研究表明，顺-冷杉醇主要存在于香料烟和雪茄烟中［10］。近年来，王国平［11］在我国特香型烤烟品种大白筋599 中检测到顺-冷杉醇，李艳华等［12］发现我国高香气烤烟品种豫烟11 号也含有顺-冷杉醇。烟叶中香气成分的准确、高效检测是高香气烟草种质资源筛选、烟叶香气品质评价的重要手段之一，长期以来备受关注，但目前有关顺-冷杉醇检测方法研究的报道较少。Severson等［10］建立了测定烟叶表面化合物的气相色谱方法，但顺-冷杉醇的热稳定性较差，导致其色谱峰峰型较差，难以准确定量。Ding 等［13］建立了测定烟草顺-冷杉醇的正相色谱方法，但正相液相色谱分析仪器普适性较差，且该方法样品前处理步骤较为繁琐。本研究中针对目前顺-冷杉醇测定方法存在的问题，以香料烟代表品种沙姆逊（Samsun）烟叶样品为实验材料，通过优化样品前处理和仪器测定条件，建立测定烟草顺-冷杉醇的反相液相色谱方法，同时，以特香型烤烟品种大白筋599 为实验材料，测定烤烟烟叶调制前后顺-冷杉醇含量的变化，旨在为含有顺-冷杉醇的高香气烟草种质筛选、品质评价、栽培及生物调控等研究提供检测技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

采集香料烟品种沙姆逊（Samsun）新鲜烟叶样品，用冻干机冷冻干燥，粉碎，过250 μm（60 目）筛，4 ℃下保存，作为烟草顺-冷杉醇检测方法研究的样品。以烤烟品种大白筋599［14］为材料，于2016 年在山东临朐五井烟草试验站种植，在成熟采烤期随机选取中部成熟叶片15 片，采用半叶法处理，即每片叶片均从烟筋边缘分开，其中，一半烟叶按当地烟叶生产技术规程烘烤，另一半烟叶冷冻干燥，粉碎，过 250 μm 筛，4 ℃下保存，作为分析烟叶烘烤前后顺-冷杉醇含量差异的样品。

顺-冷杉醇（96%，北京百灵威科技有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck 公司）；甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚（AR，中国医药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水（符合GB/T 6682—2008 中一级水的要求）。

H-Class 超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；TDZ 5-WS 台式低速离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；ALPHA1-2 冷冻干燥机（德国Christ 公司）；WD-12 水浴氮吹仪（杭州奥盛仪器有限公司）；SBL-30DT 超声波恒温清洗机（宁波新芝生物科技有限公司）；ME414S 电子天平（感量：0.000 1 g，德国Sartorius 公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

准确称取顺-冷杉醇对照品，用无水乙醇配制成浓度为0.5000 mg/mL 标准储备溶液。取标准储备溶液用70%乙腈稀释，配制成浓度分别为1.600、5.000、10.00、20.00、40.00、60.00、80.00 μg/mL 的标准工作溶液。以上标准工作溶液于4 ℃下保存。

1.2.2 样品前处理与分析

准确称取0.1g（精确至0.000 1 g）烟草粉末样品，放入20 mL 具塞离心管中（带聚四氟乙烯密封盖），准确加入5 mL 二氯甲烷作为提取剂，旋紧密封盖，20 ℃条件下超声提取10 min。提取完成后，准确移取上清液2 mL，在氮气保护条件下吹干，再准确移取 1 mL 流动相溶解，用 0.22 μm 有机相滤膜过滤，待测。UPLC-UV 分析条件为：

色 谱 柱 ：ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 µm）；柱温：35 ℃；流动相：70%（体积分数）乙腈-水溶液，进样量3 μL；等度洗脱；流速：0.3 mL/min；检测波长：237 nm。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

流动相选择：流动相对色谱分离影响较大，根据顺-冷杉醇的结构特点，本研究中选择常用的反相液相色谱柱C18柱为分离柱，分别考察了甲醇-水溶液和乙腈-水溶液（40%～80%）作为流动相等度洗脱的分离效果，结果显示，以70%乙腈作为流动相等度洗脱时，分析时间较短，目标峰峰型较好，且与杂峰分离度较好。因此，采用70%乙腈-水溶液进行等度洗脱。

吸收波长选择：根据顺-冷杉醇标准溶液紫外光谱（190～300 nm）扫描结果（图1），顺-冷杉醇在237 nm 有最大吸收峰，本研究中选择检测波长为237 nm。文献［13］中报道的正相色谱法检测波长为254 nm，由图1 可以看出，顺-冷杉醇在254 nm处的吸光度较低，因此以254 nm 作为检测波长会使方法的灵敏度降低。

流动相流速选择：考察了不同流动相流速（0.3、0.4、0.5 mL/min）下顺-冷杉醇的保留时间以及其与杂质峰的分离情况，选择流动相的流速为0.3 mL/min。

图1 顺-冷杉醇标准溶液190～300 nm 吸收光谱图Fig.1 Absorption spectrum of cis-abienol standard solution in 190-300 nm

柱温选择：考察了色谱柱温度（30、35、40 ℃）变化对顺-冷杉醇保留时间及分离效果的影响，发现色谱柱温度对目标化合物保留时间及分离效果的影响较小。因此，选择色谱柱温度为35 ℃。

基于以上色谱条件，得到顺-冷杉醇标准溶液和烟草样品的液相色谱图（图2）。由图2 可知，顺-冷杉醇的保留时间较短，峰型较好，且与其他成分实现了较好分离。对比气质联用仪方法（图3）可以看出，气相色谱分析条件下，顺-冷杉醇的色谱峰出现明显分叉，峰型较差。

图2 顺-冷杉醇标准溶液(a)和烟草样品(b)液相色谱图Fig.2 UPLC chromatograms of cis-abienol standard solution (a) and tobacco sample (b)

图3 顺-冷杉醇标准溶液气质联用总离子流色谱图Fig.3 Total ion chromatogram of cis-abienol standard solution by GC-MS

2.2 样品前处理条件的确定

2.2.1 提取溶剂选择

分别以甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚、正己烷作为提取溶剂，对不同溶剂提取烟草顺-冷杉醇含量的测定结果进行了比较（表1）。由表1 可以看出，以弱极性溶剂二氯甲烷作为提取溶剂，测定出的目标化合物含量最高，其次是极性溶剂（乙醇、乙腈、甲醇、丙酮）和中极性溶剂（乙酸乙酯），这5 种溶剂对烟草顺-冷杉醇含量的测定结果影响不显著，使用非极性溶剂（正己烷、石油醚）时，顺-冷杉醇含量最低。顺-冷杉醇是只含有一个羟基的冷杉烷型二萜醇，属弱极性化合物，根据相似相容原理，这可能是弱极性提取溶剂二氯甲烷对其提取效果较好的主要原因。因此，选择二氯甲烷作为提取溶剂。本研究中以二氯甲烷作为提取溶剂，烟叶中的色素、甾醇等脂溶性成分也会被提取出来。将提取液氮吹干，再用70%的乙腈溶液溶解后检测，部分脂溶性成分由于在70%的乙腈中的溶解性较低，而未被转移至检测液中，减少了脂溶性成分对色谱柱的污染。本方法与文献［13］报道的固相萃取纯化方法相比，操作较简单，成本降低。

表1 不同提取溶剂对顺-冷杉醇测定结果的影响(n=6)Tab.1 Effects of different extraction solvents on extraction efficiencies of cis-abienol (n=6)

2.2.2 液料比选择

分别称取 0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4 g（精确至0.000 1 g）烟草粉末样品，加入5.000 mL二氯甲烷，在20 ℃下超声提取15 min，考察不同液料比对测定结果的影响。结果（表2）表明：液料比在100∶0.5～100∶3 范围内，烟草顺-冷杉醇含量的测定结果显著较好；液料比小于100∶4 时，随着液料比的降低，测定出的顺-冷杉醇含量呈极显著降低趋势。综合考虑，液料比对测定结果的影响以及称量误差，选择提取条件为称样量0.1 g，加入 5 mL 提取溶剂，液料比为 100∶2。已有报道［13］的正相色谱检测方法中提取溶剂用量为20 mL，是本方法提取溶剂用量的4 倍。因此，本方法的提取溶剂用量较低，具有检测成本低、环境友好的特点。

表2 不同料液比对顺-冷杉醇测定结果的影响（n=6）Tab.2 Effects of material to solution ratio on extraction efficiencies of cis-abienol（n=6）

2.2.3 提取温度选择

以二氯甲烷为提取溶剂，在提取时间15 min条件下，考察了提取温度对顺-冷杉醇含量测定结果的影响。结果（表3）表明，在20～50 ℃范围内，提取温度对顺-冷杉醇影响不大。这可能与顺-冷杉醇存在于烟草表面，较易提取有关。因此，选择提取温度为20 ℃。

表3 不同提取温度对顺-冷杉醇测定结果的影响(n=6)Tab.3 Effects of extraction temperature on extraction efficiencies of cis-abienol (n=6)

2.2.4 提取时间选择

以二氯甲烷为提取溶剂，20 ℃条件下，考察了超声提取时间对顺-冷杉醇含量测定结果的影响。结果（表4）表明，在10～30 min 范围内，提取时间对顺-冷杉醇的影响不大。这也可能与顺-冷杉醇存在于烟草表面，且易提取有关［1］。因此，选择目标化合物的提取时间为10 min。

表4 不同提取时间对顺-冷杉醇测定结果的影响(n=3)Tab.4 Effects of extraction time on extraction efficiencies of cis-abienol (n=3)

2.3 方法学考察

2.3.1 工作曲线、检出限及方法定量限

采用优化确定的条件对顺-冷杉醇系列标准工作溶液进行测定，获得顺-冷杉醇浓度（Y）与峰面积（X）的线性回归方程：Y=38 700X+18 500，决定系数R2为0.999 9。顺-冷杉醇在1.60～80.00 μg/mL浓度范围内，工作曲线线性良好（图4）。

图4 顺-冷杉醇含量标准曲线Fig.4 Standard curve of cis-abienol content

以3 倍信噪比计算的顺-冷杉醇的方法检出限（3 S/N）为4.00 μg/g，以10 倍信噪比计算的方法定量限（10 S/N）为13.30 μg/g，低于文献［13］正相色谱方法的定量限（72.80 μg/g）。可见，本方法检出限及定量限均较低，方法灵敏度较高。

2.3.2 回收率及精密度

称取烟草样品0.1 g（顺-冷杉醇本底值为0.062 8 mg），进行顺-冷杉醇标准品添加回收实验。顺-冷杉醇添加量设置3 个处理，分别为0.031、0.062、0.124 mg，每处理 6 次重复。利用本文建立的方法进行前处理，并采用优化的色谱条件进行分析，计算顺-冷杉醇标准品不同添加量条件下的回收率，各处理以6 次重复回收率测定结果的RSD 评价UPLC 测定方法的精密度。结果（表5）表明，在不同加标量条件下，顺-冷杉醇回收率为97.63%～109.80%，回收率的RSD 为2.05%～3.69%，表明该方法的准确度较高，精密度较好，符合定量分析要求。

2.3.3 方法重现性

取同一份烟草样品，运用本方法，连续6 d 测定样品中顺-冷杉醇含量，其结果分别为0.629、0.612、0.598、0.642、0.659、0.630 mg/g，平均含量为0.628 mg/g，RSD 为3.43%，表明本方法重现性较好，符合定量分析要求。

2.4 实际样品分析

大白筋599 被认为是我国具有类似沙姆逊香气特征的特香型烤烟品种，顺-冷杉醇的含量较高。采用本方法对烤烟品种大白筋599 叶片烘烤前后顺-冷杉醇含量进行了检测。15 份烟叶样品半叶法进行的烘烤前后顺-冷杉醇含量配对t 检验结果（表6）表明，烟叶烘烤前后顺-冷杉醇含量差异显著（t=2.826 4，P=0.012 8），顺-冷杉醇在调制过程中大部分降解，降解率为27.92%～89.23%，平均63.66%。

表5 顺-冷杉醇回收率和精密度(n=6)Tab.5 Recoveries and RSDs of cis-abienol (n=6)

表6 烟叶烘烤前后顺-冷杉醇含量及降解率Tab.6 Contents and degradation rates of cis-abienol in tobacco leaves before and after flue-curing

3 结论

①通过优化样品提取和液相色谱分离条件，建立了测定烟草粉末样品中顺-冷杉醇的反相液相色谱方法，本方法回收率为97.63%～109.80%，相对标准偏差（RSD）为2.05%～3.69%，方法检出限为4.00 μg/g，定量限为13.30 μg/g；②通过半叶法研究了烤烟品种大白筋599 调制前后烟叶顺-冷杉醇含量差异，发现在调制过程中顺-冷杉醇大部分降解，这也进一步证明了顺-冷杉醇热稳定性较差的特性；③本方法具有样品前处理简单、分析时间短、分离度好、灵敏度高、节约溶剂、检测成本低等优点，适用于烟叶粉末样品顺-冷杉醇的批量检测。