MicroRNA-146b在大鼠肾间质纤维化模型中的表达及意义

王艺璇，赵冠杰，辛光大

(吉林大学中日联谊医院 肾内科，吉林 长春130033)

慢性肾脏病是一种严重危害人类生命健康的“全球公共健康问题”，而肾间质纤维化是多种慢性肾脏病进展为终末期肾脏病的共同途径和最可靠的预测因子[1]。目前，进一步探索肾间质纤维化的发病机制，以利于延缓肾间质纤维化的进展已经成为国内外研究的热点。

MicroRNA-146b位于10号染色体，是炎症反应的调节因子[2,3]。有研究表明microRNA-146b在肝纤维化和心肌纤维化的发病机制中发挥作用[4,5]，但尚未有文献报道其在肾间质纤维化的发生、发展中的作用。本研究通过在大鼠肾间质纤维化模型中观察肾间质纤维化的严重程度与MicroRNA-146b的表达变化，探讨microRNA-146b在肾间质纤维化发生、发展中的意义。

1 材料与方法

1.1 动物分组与造模

SPF级健康成年雄性SD大鼠20只，体重约180-210 g,购买并饲养于吉林大学实验动物中心。随机分为Sham组和UUO组，每组10只，各组再随机分为7 d、14 d两个亚组。各组大鼠于手术处理前12 h禁食、不禁水，乙醚麻醉后大鼠俯卧位固定于手术台上，Sham组大鼠开腹后游离左侧输尿管，但不结扎，分层缝合关腹。UUO组开腹后于左肾下极处游离并结扎左侧输尿管，分层缝合关腹。分别于术后7天、14天处死相应大鼠，收集左侧肾脏。

1.2 肾组织病理学检查

部分肾脏组织10%福尔马林固定后石蜡包埋，后制成4 μm的切片，行HE和masson染色。在光镜下进行肾间质损伤及纤维化的半定量评分。每张切片随机选取10个非重复视野，在光镜(×200)下观察。肾间质损伤评分按照肾小管萎缩、肾小管坏死、间质纤维化和淋巴细胞浸润4个参数进行评分[6]。前3个参数 按 0—3分评定，0：正常；1：轻度受损,病变范围<25%；2：中度受损,病变范围 25%-50%；3：重度受损，病变范 围>50%。淋巴细胞浸润也按0-3分评定，0：正常；1：轻度局限；2：轻度弥散或中度局限；3：重度弥散。4个参数得分相加为每个样本小管间质损伤评分，参数间质纤维化即为纤维化评分。

1.3 肾组织TGF-β1免疫组织化学表达

大鼠肾组织石蜡切片常规脱蜡，梯度乙醇脱水,抗原修复后加入3% H2O2室温静置15 min孵育。山羊血清室温孵育15分钟，一抗加入抗 TGF-β1(1∶200),4 ℃孵育过夜，HRP标记二抗。DAB 显色、苏木素复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、封片。在光镜(×400倍)下观察,每张切片随机选取6个不重复视野。应用Image Pro Plus 图像分析软件计算累积光密度(integrated optical density，IOD)，取其平均值进行统计学分析。

1.4 RT-PCR检测肾组织中MicroRNA146b表达

分别取各组大鼠肾组织 100 mg,样本进行总 RNA 提取,并测定浓度,按照PrimeScriptTMRT reagent kit(TaKaRa,Japan) 说明书方法逆转录合成 cDNA 模板。qRT-PCR采用SYBR Green法，以GAPDH为内参。MicroRNA146b 正向引物：5’-GAGAACTGAATTCCATAGGCT-3’，反向引物:5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；GAPDH正向引物:5’-ATGTTTGTGATGGGTGTGAA-3’，反向引物:5’-ATGCCAAAGTTGTCATGGAT-3’。反应体系为cDNA模板1 μl；上下游引物(10 μM) 各0.5 μl；SYBR GREEN mastermix 10 μl；用ddH2O补足至20 μl。反应条件为 94.0℃，2 min预变性； 94.0 ℃，15 s变性； 60.0 ℃，15 s退火；72.00 ℃，15 s延伸。所有样品均作3个复孔。采用2-△△Ct法计算相对表达量。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠病理组织学变化

Sham组(7 d和14 d)大鼠肾小管形态正常，结构清晰，偶见肾小管上皮细胞坏死及淋巴细胞浸润，无肾小管萎缩，可见微量胶原纤维。UUO 组术后7天，部分肾小管上皮细胞空泡变性或坏死脱落，部分肾小管扩张或灶状萎缩，间质增宽，灶状淋巴细胞浸润，可见胶原纤维沉积。病理评分比7dSham组明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)。术后14天，肾小管片状萎缩及坏死，淋巴细胞广泛浸润，肾间质明显增宽，大量胶原纤维沉积。病理评分较14dSham组和7dUUO组明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。(见图1、表1)。

图1 各组大鼠病理组织学形态(×200)

表1 各组大鼠肾病理组织学评分

2.2 各组大鼠肾脏组织TGF-β1免疫组织化学表达

Sham组大鼠肾组织可见微量 TGF-β1 表达，UUO 组7 d 和 14 d 大鼠肾脏组织TGF-β1的累计光密度均较同时间点 Sham 组明显增高，差异有统计学意义(P<0.05);并且UUO组14 d大鼠肾组织TGF-β1的累计光密度较7d增高，差异有统计学意义(P<0.05)。(见图2、表2)

图2 各组大鼠肾组织TGF-β1表达水平(×400)

表2 各组大鼠肾组织TGF-β1表达水平

2.3 各组大鼠肾组织MicroRNA146b表达水平

Sham组术后第7天、14天肾组织MicroRNA-146b表达水平明显低于相应UUO组，差异有统计学意义(P<0.05)。并且7dUUO组大鼠MicroRNA-146b表达水平明显低于14dUUO组，差异有统计学意义(P<0.05)。(见表3)

表3 各组大鼠肾组织MicroRNA146b表达水平

2.4 相关性分析

肾组织 MicroRNA-146b与肾间质损伤、肾纤维化程度及TGF-β1表达水平呈正相关(r=0.858、0.765、0.647,P<0.01)。

3 讨论

肾纤维化以肾间质成纤维细胞的增生、细胞外基质的过度积聚，以及肾单位萎缩消失等为主要病理特点[7]，是多种不同类型肾脏损伤进展为终末期肾脏病的共有病理改变[8]。也是反映肾功能下降严重程度和判断预后的主要指标[9]。其发生机制涉及炎症、凋亡、氧化应激及多种细胞因子作用等方面。 目前研究表明,慢性持续性炎症促进肾间质纤维化的形成，是慢性肾病进展的重要机制[10]。

MicroRNA-146b 是 miR-146家族中的一员,主要调节炎性反应，通过参与靶基因转录后的表达和调控，在人体固有免疫、肿瘤侵袭转移、肝纤维化、心肌梗死及急性肾损伤等多种疾病中发挥重要作用[4，11-16]。在本研究中肾脏病理组织学及免疫组织化学结果显示UUO组大鼠出现肾间质损伤及纤维化，并且随着造模时间延长，肾间质损伤及纤维化程度加重。而且，UUO组大鼠肾组织中 microRNA-146b表达上调,并与肾间质损伤及纤维化程度呈正相关,提示 microRNA-146b参与了肾纤维化的进展，这与我们之前的研究结果一致[17]。

近年研究表明KLF4是MicroRNA-146b调控的靶基因之一，它是一种锌指蛋白，microRNA-146b通过靶向其3′-UTR抑制了KLF4的表达。而KLF4可抑制Smad2/3与α-SMA启动子的结合，降低α-SMA的表达[18,19]，是TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT的抑制因子。下调的KLF4减弱了其对TGF-β1/smad通路的抑制作用，促进了纤维化的进展。本研究也观察到MicroRNA146b与TGF-β1具有相关性。我们推测microRNA-146b通过KLF4参与了TGF-β1/smad通路的调控，促进了肾纤维化的进展，这需要进一步的实验进行验证。

综上所述,随着肾纤维化程度加重，UUO组大鼠肾组织中 microRNA-146b表达上调,且具有正相关性，提示microRNA-146b对肾纤维化的发生、发展起促进作用。该作用可能是microRNA-146b通过KLF4参与了TGF-β1/smad通路的调控，促进了肾纤维化的进展，尚需要进一步实验研究明确MicroRNA-146b在肾纤维化中的作用机制，以利于进一步寻找预测及诊断慢性肾脏病的新型标志物及治疗靶点。