白藜芦醇对绝经后骨质疏松症大鼠的促细胞增殖作用

邹庆峰, 李守民, 舒隆钧, 刘世昌, 张继源

(云南省大理市第一人民医院 骨科, 云南 大理, 671000)

绝经后骨质疏松症(PMOP)是中老年妇女的常见疾病[1]。PMOP的发生与雌激素减少后导致细胞核因子κB受体活化因子配体/细胞核因子κB受体活化因子/骨保护素(RANKL-RANK-OPG)轴的紊乱、破骨细胞增殖及活性增强有关[2-4]。白藜芦醇(RES)是从传统中药材虎杖中提取的活性单体, 化学名称为3, 4′-5-三羟基二苯乙烯, RES是否具有调控细胞增殖抗PMOP尚未报道[5]。本研究通过切除6月龄雌性SD大鼠双侧卵巢建立PMOP大鼠模型，同时采用不同浓度的RES预治疗，并于24周后取材，通过检测各组骨组织的骨密度、增殖相关因子p53和Cyclin-D1的mRNA水平、细胞增殖的调控信号分子Notch-1的表达水平，探讨RES对PMOP大鼠模型的保护作用，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 实验动物: 清洁级雌性SD大鼠80只, 6月龄未交配，体质量为(360.0±10.0) g, 购自昆明医科大学实验动物学部，动物生产许可证号为SCKK(滇)2018-0008。

1.1.2 主要试剂: RES(纯度98%, 西安天本生物科技有限公司), p53和Cyclin-D1基因的引物合成、Trizol、RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司)。Notch-1一抗(美国Santa cruz公司)。

1.2 方法

清洁级雌性SD大鼠80只，随机分为对照组、PMOP组、RES低剂量预处理组(60 mg/kg)、RES中剂量预处理组(80 mg/kg)、RES高剂量预处理组(100 mg/kg), 每组16只，适应性喂养1周后开始实验。各组均采用7.2%水合氯醛(按5 mL/kg)腹腔注射麻醉，采用碘伏进行腹部消毒，经背外侧入路切除双侧卵巢，缝合腹壁。对照组切除卵巢旁卵巢系膜组织(与卵巢等大)，保留卵巢，逐层缝合，术后给予青霉素(60万U/kg)治疗3 d。RES低、中、高剂量治疗组分别给予RES[二甲基亚砜(DMSO)溶解，注射用蒸馏水配置，其中DMSO在溶液中的体积分数为0.1%]60、80、100 mg/(kg·d)灌胃。给药 24 周，所有动物均分笼饲养，定量给食，饲养于SPF级动物房。实验结束，麻醉动物后取材。

1.3 评价指标

1.3.1 椎骨和股骨的骨密度(BMD)检测: 取大鼠的左侧股骨和椎骨，采用双能X线吸收法测定大鼠椎骨和左侧股骨远端干骺端的骨密度。

1.3.2 骨组织的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测: 研钵高压灭菌后，用DEPC水浸泡12 h, 将左侧股骨近端的干骺端置于研钵中，倒入液氮，研碎后将组织移入2 mL离心管中，迅速向离心管中加入1 mL TRNzol, 并用组织匀浆机充分匀浆。采用RNA提取试剂盒提取总RNA, 逆转录试剂盒合成cDNA, 然后扩增目的片段, p53上游引物为5′GCAGCGATGAGGAGATCTTT 3′, 下游引物为5′GGGCTCAGATGATTCACGAT 3′; Cyclin D1上游引物为5′ GTTCTCGGCCAGCACCAT, 下游引物为5′ CAGCATACAATCTCGCACC 3′, PCR扩增，进行PCR产物鉴定及定量分析。

1.3.4 骨组织中Notch-1表达水平的测定: 取右侧股骨近侧干骺端，研钵研碎，加入蛋白裂解液，组织匀浆机匀浆。离心取上清，蛋白定量，按每孔80 μg蛋白量上样。配10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，转印，恒流转膜，封闭，加兔抗Notch-1一抗，1∶1 000, 4 ℃, 过夜; TBST漂洗，加入辣根酶标记山羊抗兔(H+L)二抗(中杉金桥, 1∶2 000)，孵育1 h, TBST漂洗，成像。扫描条带，并用Image J进行分析。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 各组大鼠的骨密度检测

PMOP组大鼠股骨和椎骨的骨密度降低, RES不同剂量组大鼠股骨和椎骨的骨密度较PMOP组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠股骨和椎骨的骨密度比较 g/cm3

2.2 大鼠右侧股骨干骺端骨组织中p53和Cyclin-D1的mRNA的变化

与对照组相比, PMOP组p53和Cyclin-D1的mRNA转录水平显著增高, RES不同剂量组的Cyclin-D1的mRNA转录水平较PMOP组升高，而p53的mRNA转录水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

A: p53的相对表达水平; B: Cyclin-D1的相对表达水平。与对照组比较, *P<0.05; 与PMOP组比较, #P<0.05。

2.3 各组大鼠骨组织中相关蛋白表达的变化

取SD大鼠右侧股骨，提取蛋白，采用Western blot法检测Notch-1的表达水平。结果显示, PMOP组的Notch-1表达水平显著抑制, RES不同剂量组Notch-1蛋白表达较PMOP组升高，差异有统计学意义(P<0.05), 见图2。

A: Western blot法检测Notch-1的表达; B: 各组Notch-1表达比较。与对照组比较, *P<0.05; 与PMOP组比较, #P<0.05。图2 Western blot检测各组大鼠骨组织中Notch-1的表达水平

3 讨 论

PMOP好发于绝经后妇女、老人和慢性疾病患者，其病理学特点是骨量减少、骨微观结构退化、骨脆性增加和易发生骨折[6]。临床上在研究PMOP的病理生理机制时，通常选择6～9月龄的雌性大鼠行双侧卵巢切除，复制PMPO动物模型[7]。本研究采用去卵巢骨质疏松的大鼠模型研究RES的抗PMOP作用，在造模6个月后, PMOP组骨密度显著低于对照组，表明本研究成功复制了PMOP大鼠模型[8]。RES不同剂量治疗组骨密度显著高于PMOP组，表明RES有较好的抗骨质疏松症的效果。

研究[9]表明, p53基因可阻滞正常细胞从G1期进入S期，负调控细胞的分裂及增殖。Cyclin-D1调控细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)而发挥作用。吴银生[11]报道去卵巢骨质疏松模型大鼠发病过程中，随着雌激素水平的下降，成骨细胞Cyclin-D1表达明显增高，成骨细胞增殖加快; 同时，成骨细胞周期受阻滞亦增多，成骨细胞数量仍相对不足，最终导致骨质疏松的发生。本研究中，与对照组相比, PMOP组p53和Cyclin-D1的mRNA转录水平显著增高, RES不同剂量组的Cyclin-D1的mRNA转录水平较PMOP组升高，而p53的mRNA转录水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05), 提示RES具有促进大鼠骨组织中细胞增殖的作用。

Notch信号在骨骼发育和骨重塑中起重要作用[12]。在典型的Notch通路中，利用α分泌酶和γ分泌酶进行一系列反应。Notch细胞内结构域(NICD)从细胞膜释放出来转移到细胞核，激活靶基因的转录[13]。Notch信号的遗传改变可导致人类和小鼠的严重骨骼疾病。研究[14]还表明, Notch信号转导抑制体外成骨细胞分化，并且可导致体内骨质减少, Notch-1参与了PMOP的病理过程。本研究发现, PMOP组的Notch-1蛋白表达下调, RES不同剂量组Notch-1蛋白表达较PMOP组升高，差异有统计学意义(P<0.05), 提示RES通过激活雌激素受体调控Notch 信号通路来发挥保护作用。