生大黄粉治疗新生鼠坏死性小肠结肠炎实验研究

贾艳萍，谢秀春，贾毛毛，马丹阳，罗世杰，冯爱民*

（陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000）

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）为新生儿期一种严重的胃肠道疾病，是导致新生儿肠穿孔及全身炎症反应综合征（systemin inflammatory response,SIRS）的主要原因之一[1]，也是导致新生儿死亡的重要病因[2]。

随着早产儿存活率的不断提高，NEC 发病率明显增加，在低出生体质量儿中约为2.50%，在极低出生体质量儿中约为4.53%[3]，病死率高达15%～30%[4]，尚无特效防治手段。NEC 确切的病因及发病机制尚不明确，目前研究认为，NEC 的发生主要由于多种致病因素综合作用于发育尚不成熟的胃肠道，使肠黏膜局部缺血，肠道蠕动功能减弱，食物在肠腔内滞留，致胃肠功能紊乱，使致病菌繁殖，引起肠道炎症反应，激发炎症风暴。如肠壁缺血/缺氧及再灌注损伤[5-6]、早产[7-8]及低出生体质量[9]、感染及炎症反应[10-11]、喂养不当[12]等综合影响下导致NEC 的发生。在上述各致病因素的作用下，NEC 引起肠道功能障碍，造成肠道内中性粒细胞浸润、黏膜下水肿、出血，消化道绒毛结构破坏，甚至穿孔或坏死等病理改变，发生败血症、感染性休克等严重并发症[13]。因此NEC 的恰当治疗对提高生存率，改善预后至关重要。

现代药理研究证实，大黄具有保肝利胆[14]、抑制多种菌种[15]、泻下、活血、止血、调节血脂[16]、保护肠道黏膜屏障、降低肠道细菌移位率[17]等作用。本课题对生大黄粉治疗新生鼠NEC 的效果进行了研究，同时，通过对肠组织匀浆胃动素（MTL）和促胃液素（GAS）含量的测定，探讨其治疗机制，以期为临床应用生大黄粉治疗新生儿NEC 提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 早产儿配方奶粉（特别能恩）由雀巢公司提供；汤臣倍健蛋白粉购自汤臣倍健股份有限公司；脂肪乳注射液（C14-C24）由华瑞制药有限公司提供；脂多糖（LPS）购自北京Solarbio 公司；CY-12C 型便携式数字测氧仪；大鼠GAS ELISA 检测试剂盒（批号：YX-O72000R）、大鼠MTL ELISA 检测试剂盒（批号：YX-132012R）；医用纯氮气：纯度≥99.9%，由陕西中医药大学实验中心提供；医用纯氧气：由陕西中医药大学附属医院制氧站提供；生大黄粉购自陕西中医药大学附属医院制剂室，生大黄粉液配制方法：大、中、小剂量组分别取2.04、1.02、0.51 g 生大黄粉，分别直接加入15 mL 热水中，0.1 mL 生大黄粉液中含生大黄剂量分别为0.013 6 g，0.006 8 g，0.003 4 g。

1.2 动物与分组 SPF 级新生2 d 龄SD 大鼠72 只，生产许可证：SCXK（川）2015-030，购自成都达硕实验动物有限公司。将体质量5～12 g 新生大鼠采用随机数字表法分为6 组，每组12 只。A 组仅接受人工喂养；B 组接受人工喂养+缺氧复氧冷刺激+LPS+生理盐水；C 组接受人工喂养+缺氧复氧冷刺激+LPS+西咪替丁；D 组接受人工喂养+缺氧复氧冷刺激+LPS+大剂量生大黄；E 组接受人工喂养+缺氧复氧冷刺激+LPS+中剂量生大黄；F 组接受人工喂养+缺氧复氧冷刺激+LPS+小剂量生大黄。

1.3 方法

1.3.1 人工喂养 新生SD 大鼠在出生后48 h 置于保育箱内（温度28～30 ℃，湿度45%～65%），采用代乳品人工喂养，代乳品配制见表1，每100 mL 代乳品添加早产儿奶粉6.0 g，蛋白粉10.7 g，脂肪乳48.9 mL，总热量约7020 kJ，采用6 号灌胃针定时经口插管喂养，第1 天给予0.2 mL/6 h，随后每24 h 增加0.1 mL，48 h 后逐渐增至0.4 mL。

表1 人工喂养代乳品配方与鼠乳主要成分的比较

1.3.2 缺氧、复氧及冷刺激 CY-12C 型测氧仪调零后，将探头连接至缺氧箱出口处，入口处充入氮气，打开氮气罐流量表，控制氮气流量为15 L/min，当缺氧箱氧浓度为零时迅速将除A 组外余60 只新生鼠置入，90 s 后关闭氮气阀，打开缺氧箱，取出新生鼠，随后将其置入含100%氧气的复氧箱中，10 min 后将新生鼠置于4 ℃冰箱冷藏，持续10 min 后放回保育箱，每日2 次，连续3 d。

1.3.3 LPS 腹腔注射LPS 0.1 mL（10 mg/kg），每日1 次，连续3 d。

1.3.4 药物治疗 B 组灌胃生理盐水0.1 mL，C 组灌胃西咪替丁0.1 mL（相当于0.000 34 mg），D 组每次灌胃生大黄粉液0.1 mL（含生大黄13.6 mg），E 组每次灌胃生大黄粉液0.1 mL（含生大黄6.8 mg），F 组每次灌胃生大黄粉液0.1 mL（含生大黄3.4 mg），均间隔8 h 给药1 次，连续3 d。

1.3.5 组织病理评分标准 所有动物于第4 天空腹颈椎脱臼处死，取回盲部近端肠组织上下各1 cm 立即固定，脱水，石蜡包埋，切片及HE 染色，参照文献[18]评分标准进行双盲肠组织病理评分：0 分为肠绒毛及上皮完整，组织结构正常；1 分为轻度黏膜下和（或）固有层肿胀分离；2 分为中度黏膜下和（或）固有层肿胀分离，黏膜下和（或）肌肉层水肿；3 分为重度黏膜下和（或）固有层肿胀分离，黏膜下和（或）肌肉层水肿，局部绒毛脱落；4 分为肠绒毛消失和（或）伴肠坏死；组织评分≥2 分，确定为NEC。

1.3.6 肠组织GAS、MTL 含量检测 将剩余肠组织置于冰生理盐水中漂洗、滤纸拭干称重，冰浴下制作10%肠组织匀浆，4 ℃低温离心，3 500 r/min，离心15 min，取上清液分装于EP 管中，置于-80℃冰箱中待测，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组新生鼠MTL、GAS 含量。

1.4 统计学方法 实验数据采用SPSS 22.0 统计软件分析，治疗前后各组之间采用单因素方差分析（ANOVA），方差齐者用LSD 比较，方差不齐者用Tamhane´s 比较，等级资料用Kruskal-Wallis H 检验；以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况及体质量变化

2.1.1 一般情况 B 组、C 组、D 组、E 组、F 组在造模后新生鼠均出现活动减少，倦怠，反应迟钝，喂养困难、吐奶及胃潴留，腹部胀满，进而可见大便颜色性状发生改变，均不同程度排黄绿便或黑色稀便。除A组外，余各组在缺氧过程中新生鼠均出现烦躁、抽搐、呼吸困难、紫绀、大小便失禁。复氧后新生鼠逐渐恢复自主活动，肤色转红，其中D 组、E 组、F 组复氧需几十秒至1 min 不等，B 组、C 组复氧约需3 min；冷刺激10 min 后，新生鼠出现全身皮肤冰冷，黏膜苍白，立即置于保育箱保暖，D 组、E 组、F 组肤色不足1 min 恢复，B 组、C 组约2～3 min 肤色恢复。A 组活动度可，纳乳及排便正常，无腹胀及腹泻。

2.1.2 各组实验前后NEC 动物体质量比较 各组新生鼠实验前体质量、实验后体质量，见表2。经单因素方差分析（ANOVA），实验前A 组、B 组、C 组、D组、E 组、F 组新生鼠体质量相似（P＞0.05）。实验结束后，根据LSD 多重比较进一步推断，各组间体质量比较：A 组＞E 组＞D 组＞F 组＞C 组，B 组与C组体质量无差异。结果表明，生大黄（粉）及西咪替丁对NEC 大鼠体质量增长有改善作用，且前者优于后者，见表2。

表2 各组实验前后NEC 动物体质量及其差值比较（，n =12） g

表2 各组实验前后NEC 动物体质量及其差值比较（，n =12） g

注：与其他各组比较，# P ＜0.05

2.2 新生鼠肠组织HE 染色病理学改变 用HE 染色法记录新生鼠肠组织回盲部形态变化，光镜下可观察到D 组、E 组、F 组肠绒毛生长旺盛，结构相对整齐，部分轻度水肿，黏膜下层和固有层轻度分离，分离程度较B 组、C 组明显减轻（图1-D、图1-E、图1-F）；B 组、C 组新生鼠肠组织损伤严重，黏膜下层和固有层肿胀分离明显，肠绒毛水肿，黏膜下层及固有层可见嗜酸性粒细胞、中性粒细胞浸润（图1-B、图1-C）；A 组肠组织结构完整清晰，黏膜层、黏膜下层及固有层未见明显分离，且无炎症细胞浸润（图1-A）。

图1 NEC 模型治疗后各组新生鼠肠组织（HE，×100）

2.3 不同干预方式对NEC 动物模型病理评分的比较 新生鼠肠组织病理评分结果，见表3。由于肠组织病理评分为等级资料，不符合正态分布，采用Kruskal-Wallis H 检验后，P＜0.05，故各组间病理评分存在显著差异；D 组、E 组、F 组之间比较结果显示，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 不同干预方式对NEC 动物模型病理评分的比较（，n =12）

表3 不同干预方式对NEC 动物模型病理评分的比较（，n =12）

注：与B 组比较，# P ＜0.05

2.4 各组肠组织匀浆中MTL、GAS 含量比较 各组新生鼠肠组织MTL、GAS 含量见表4，各组间MTL含量比较：A 组＞D 组＞C 组＞B 组，A 组＞E组＞C 组＞B 组，A 组＞F 组＞C 组＞B 组，D 组、E 组及F 组之间MTL 含量相似，差异无统计学意义，说明缺氧等肠损伤后，肠组织内MTL 表达降低，经生大黄粉治疗后，可使肠组织中MTL 升高；各组间GAS 含量比较：B 组＞C 组＞D 组＞A 组，B 组＞C组＞E 组＞A 组，B 组＞C 组＞F 组＞A 组，D 组、E 组及F 组之间GAS 含量相似，差异无统计学意义，说明缺氧等肠损伤后，肠组织内GAS 表达升高，经生大黄粉治疗后，可使肠组织中GAS 表达降低。

表4 各组肠组织匀浆中MTL、GAS 含量比较（，n =12） pg/mL

表4 各组肠组织匀浆中MTL、GAS 含量比较（，n =12） pg/mL

注：与B 组比较，# P ＜0.05

3 讨论

中医学中并没有特定的“坏死性小肠结肠炎”病名，根据患者表现出的“腹胀、便秘、呕吐”等症状，当属中医“痞满”“便秘”“呕吐”“呃逆”等范畴，其病位在脾、胃、大肠、小肠等。坏死性小肠结肠炎的病因尚不明确，多认为与初生儿、胎怯儿先天禀赋不足，脏腑娇嫩，形气未充有关。坏死性小肠结肠炎的根本病机是气机逆乱、脾胃功能失调。NEC 的内科治疗以禁食、胃肠减压、胃肠外营养、有效抗菌药物抗感染、液体复苏、辅助通气等对症支持治疗为主[19-20]，外科主要通过手术治疗。在西医治疗的基础上，生大黄粉对NEC 有非常显著的防治作用[21]，其作用机制与抑制NF-κB P65 蛋白表达相关，大黄上清液可抑制Caco-2 炎症细胞Toll 样受体的表达，减轻炎症反应。

生大黄性味苦寒，入脾、胃、肝、大肠、心包经；能下瘀血、通血闭；推陈致新，破癥瘕积聚，除留饮宿食；攻积导滞，宣通气机；调畅脾胃气机，具有泻下作用；生大黄调畅脾胃气机的作用与坏死性小肠结肠炎气机逆乱，脾胃功能失调相契合。诸多研究证实，生大黄对胃肠道调节作用明显。研究表明，大黄具有减轻氧自由基损害，抑制肠道炎症反应[22]，促进平滑肌收缩，保护消化道黏膜，增加胃动力，促进止血等作用[23]。

MTL 和GAS 是对胃肠功能有重要调节作用的激素。MTL 作用于消化系平滑肌上的胃动素受体，导致平滑肌收缩加强，加速胃排空和缩短食物在小肠内的停留时间，起着“清道夫”的作用[24-25]。GAS 是由胃窦及十二指肠和空肠上段黏膜中G 细胞分泌的一种胃肠激素，其主要生理作用是刺激胃肠道的分泌，使胃酸、胃蛋白酶分泌增加，促进胃粘膜血流量增加、胃平滑肌收缩[26-27]。它能促进胃的运动，也能增强幽门括约肌的收缩，其总效应是延缓胃排空。本实验结果显示，与生理盐水组比较，生大黄治疗组MTL 升高、GAS 降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与西咪替丁组比较，生大黄治疗组中MTL 表达高于西咪替丁组，GAS 表达低于西咪替丁组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；生大黄各剂量组之间比较，MTL、GAS表达相似，差异均无统计学意义（P＞0.05）。HE染色结果显示，生大黄治疗组肠绒毛结构相对整齐，部分轻度水肿，黏膜下层和固有层轻度分离，生理盐水组、西咪替丁组肠组织损伤严重，黏膜下层和固有层肿胀分离明显，肠绒毛水肿，黏膜下层及固有层可见嗜酸性粒细胞、中性粒细胞浸润；生大黄治疗组其病理评分均值低于生理盐水组及西咪替丁组，且相同实验因素下其发病率明显减低。

综上所述，生大黄粉能够降低新生鼠NEC 模型肠损伤程度，且效果优于西咪替丁，提示生大黄粉有可能成为防治NEC 的一种有效药物。本实验结果提示不同剂量生大黄对肠损伤病理切片改善无明显差异，且生大黄作为单味中药，目前对其吸收代谢、作用机制、药物效果的研究还不全面，特别是在治疗NEC 方面仅处于探索阶段，还需要大量研究奠定基础。