长白山地区龙胆生产品质影响因素探究

武靖涵，左 柏，张天柱*

（1.长春中医药大学药学院，长春 130117；2.吉林省北药药材加工有限公司，长春 130000）

龙胆为龙胆科植物龙胆Gentiana scabra Bge.、条叶龙胆Gentiana manshurica Kitag.、三花龙胆Gentiana triflora Pall.或坚龙胆Gentiana rigescens Franch.的干燥根和根茎[1]。首载于《神农本草经》，其味苦，性寒，归肝、胆经，有清热燥湿、泻肝胆火的作用[2]。除坚龙胆外，主产于内蒙古、河北及东北三省地区。

近年来，由于中药用量大幅度增加，促使饮片生产逐渐由小规模作坊式转向现代化、工业化、标准化和规范化，且随着《中华人民共和国中医药法》的实施和中药标准化项目的设立，饮片标准化生产的重要性也逐渐显现[3-6]。龙胆作为常用大宗药材，饮片生产过程较为简单，主要有“选、洗、润、切、干”五道工序。在前期已得出龙胆在实际工业中最佳生产方法的基础上，本研究选择不同产地、不同等级的龙胆药材，以龙胆苦苷和水溶性浸出物的含量为指标，探究饮片生产过程中对其质量产生影响的因素，为龙胆从药材到饮片的生产过程中的质量传递提供依据。

1 材料与仪器

1.1 材料 龙胆苦苷对照品（批号：110770-201013）购于中国药品生物制品检定所，甲醇为分析纯（北京化工厂）、色谱纯（Fisher Chemical）；水为超纯水。龙胆药材由吉林北药药材加工公司提供，基源由各产地工作人员鉴定龙胆药材来源，见表1。

1.2 仪器 PM1 000 高效液相色谱仪（日立仪器有限公司），BT25S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司），PTX-FA110S 万分之一电子天平（福州华志科学仪器有限公司），YM-100S 超声波清洗机（深圳市语盟超声波清洗剂设备厂），Medium-s300 实验室纯水系统（上海和泰仪器有限公司）。

炮制机械设备来自吉林省北药药材加工有限公司药品生产质量管理规范（GMP）车间，主要有筛选机（型号：SX-2，富阳亳州康华制药机械有限公司）、振动筛（型号：XZS-2，天津市渤海鑫茂制药设备有限公司）、变频风选机（型号：FX-1，天津市渤海鑫茂制药设备有限公司）、热风循环烘箱（型号：CT-C-I，南京飞翔干燥制冷设备厂）、直线往复式切药机（型号：WFQY-300，天津市渤海鑫茂制药设备有限公司）。

表1 龙胆药材来源

2 方法与结果

2.1 龙胆苦苷含量测定方法

2.1.1 色谱条件 PM-1 000 日立高效液相色谱仪；色谱柱Agilent XDB-C18 柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流动相为甲醇（A）:水（B），洗脱程序为：0～20 min，20%A，20～80 min，25%～75%A，80～90 min，100%A，90～100 min，20%A；流速为0.8 mL/min；柱温为35℃；检测波长为243 nm；进样量为10 μL。

2.1.2 对照品溶液的制备 取一定量龙胆苦苷对照品置于20 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成浓度为1.201 mg/mL 的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取批次1 龙胆适量，粉碎，过四号筛，取约0.5 g，精密称定，置20 mL 容量瓶中，加50%甲醇约18 mL，超声（功率250 W，频率20 kHz）30 min，取出，放冷，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.1.4 线性关系 取“2.1.2”对照品溶液，分别进样4、8、12、16、20、24 μL，测定峰面积。以进样体积、峰面积为横、纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为Y=1,413,755,967.65X-57,438.07，r=1.00，在4.802～28.812 μg 范围内，龙胆苦苷线性良好。

2.1.5 重复性 在批次1 中平行取6 份样品，按“2.1.3”方法制备供试品溶液，按“2.1.1”条件依次进样，记录色谱峰面积，计算龙胆苦苷含量。测定结果为：龙胆苦苷含量平均为4.788%，RSD 为：0.09%，方法重复性良好。

2.1.6 稳定性 取批次1 样品适量制备供试品溶液，室温下放置，在0、4、8、12、16、20、24 h 按“2.1.1”方法分别测定，记录峰面积。龙胆苦苷色谱峰面积RSD 为0.51%，供试品溶液24 h 内稳定性良好。

2.1.7 精密度 取批次1 同一供试品溶液，按“2.1.1”条件连续进样测定6 次，记录峰面积。龙胆苦苷色谱峰面积RSD 为0.23%，仪器精密度良好。

2.1.8 加样回收率 取批次1 龙胆粉末样品（已知成分含量）6 份，约0.5 g，精密称定，加入龙胆苦苷对照品适量，按“2.1.3”方法制备加样供试品溶液，按“2.1.1”条件测定，记录峰面积，计算含量及回收率。结果龙胆苦苷回收率为99.93%，RSD 为1.09%。回收率在95.0%～105.0%之间，RSD 均小于3.0%，该方法回收率较好。

2.1.9 样品测定 称取龙胆样品，按“2.1.3”项下操作制备龙胆供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，分别进样10 μL，测定峰面积，见图1 和图2。各样品龙胆苦苷及水溶性浸出物含量，见表2。各批次龙胆中龙胆苦苷含量均符合《中国药典》2015 版标准。

2.2 龙胆药材指纹图谱的建立 取12 批龙胆药材粉末，按“2.1.2” “2.1.3”方法制备对照品溶液和供试品溶液，按“2.1.1”色谱条件依次测定，得到色谱图（图1、图2）。将12 批次龙胆样品的色谱图导入2004 版中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件，进行多点校正及自动匹配，以S1 为参照图谱，选用中位数法，时间窗宽度0.1 min，得到对照图谱R，12 批次龙胆药材指纹图谱，见图3。经过匹配，确认13 个共有色谱峰，再与对照品色谱图相比较，确认13 个共有特征峰中，5 号峰为龙胆苦苷。以5 号峰龙胆苦苷为参照峰（S），计算各共有峰的相对保留时间及其RSD，并应用软件计算相似度。计算结果为，各共有峰保留时间的RSD分别为0.33%、0.39%、0.20%、0.38%、0.00%、0.25%、0.31%、0.14%、0.15%、0.19%、0.19%、0.16%、0.14%，相似度均大于0.9。指纹图谱结果表明各批次龙胆样品质量较稳定，无明显差异。

图1 混合对照品 HPLC 图谱

图2 龙胆样品S1 HPLC 图谱

图3 12 批龙胆药材指纹图谱

2.3 水溶性浸出物测定 按照水溶性浸出物测定法（《中国药典》2015 版第四部通则2201）项下的热浸法测定，结果见表2。

2.4 生产过程样品测定 龙胆饮片生产过程可分为如下工序：拣选、水洗、润制、切制和干燥。依据前期实验室正交试验及实际生产验证，龙胆实际生产过程为龙胆药材经筛选及人工拣选后，快速“抢水洗”，闷润2 h，切段，自然晾干。对品质产生影响的因素主要为水洗、润制和干燥三个环节。为在同一条件下比较样品质量，规定“抢水洗”时长统一为60 s。样品制备过程，见图4，各批次样品测定结果，见表2。

各批次样品中龙胆苦苷与水溶性浸出物含量变化趋势见图5 和图6[7]。由折线图及文献得出，龙胆苦苷含量经“抢水洗”后，非药用部位、杂质被除去，龙胆苦苷实际含量未变但相对含量升高；经润制后龙胆苦苷含量增减不定，是由于润制过程中龙胆苦苷溶于水后水留存或流失导致；经干燥后龙胆苦苷含量明显增加[8-11]。龙胆经水洗后水溶性浸出物明显减少，表明水洗工序带走部分浸出物，所以在完成洗净的前提下应尽量缩短水洗时间；润药后，浸出物少量增加，推测由于龙胆内水溶性裂环烯醚萜苷类成分继续溶出；干燥后浸出物明显增加。

图4 样品制备过程

表2 各样品龙胆苦苷及水溶性浸出物含量 %

图5 1～6 批次样品含量变化

图6 7～12 批次样品含量变化

3 结语

本实验在药典基础上，对检测波长、洗脱程序及龙胆样品的提取方法和溶剂进行优化。实验过程中发现，其他条件相同情况下，检测波长243 nm 得到的谱图相对于270 nm 得到的谱图色谱峰数量更多，峰形更好，可增加指纹图谱中的共有峰数量，使评价更全面。流动相在《中国药典》甲醇—水（25:75）的基础上，根据出峰时间、分离度、峰形等进行调节，最终确定洗脱程序为0～20 min，20%A，20～80 min，25%～75%A，80～90 min，100%A，90～100 min，20%A，使各峰之间分离分析效果较好，利于计算。提取方法方面分别考察加热回流15 min、超声提取（功率250 W，频率20 kHz）30、45、60 min，比较3 个成分的含量，结果较为相近，由于超声提取法简单易行，故选择超声提取30 min。提取溶剂考察100%甲醇、70%甲醇、50%甲醇，其余条件相同情况下，结果显示50%甲醇提取效果较好且节约成本，故选择提取溶剂为50%甲醇[12-14]。

龙胆生产过程中，已广泛使用炮制机械[15]。拣选一步，单独使用筛选机或风选机等炮制机械，拣选效果不佳，残留杂质较多，虽然采用人工效果较好，但是会导致时间和人工成本大幅度增加，所以实际生产中一般采用先筛选或风选，出去部分杂质，再进行人工拣选，除去根部细小杂质或多余须根、残茎。水洗一步，一般无明确时间要求，但由于龙胆苦苷等成分溶于水，所以水洗时间应尽量减少，最短时间内洗净泥沙及多余杂质，称“捞洗”或“抢水洗”。润药一步，由于龙胆整体体积较小，水洗后表面留存水量较少，润药过程中易蒸发，实际生产中一般采用闷润，即在润药容器表面加盖一层隔水隔热材料，减少水分散失，使闷润更充分[16]。切制一步，虽然有设定长度，但是由于原料药材在传动带上的摆放位置、前进速度及往复式切药机刀口升降频率、机器精度等问题，并不能做到切制后的饮片长度精确一致，一般在±3 mm 范围内浮动，依据《中国药典》2015 版第四部炮制通则中关于切制短段长度为5～10 mm 的规定，可设定仪器切制长度为7 mm[17-18]。切制工序经过查找文献、进行预实验和咨询饮片生产车间技术人员后，视为对龙胆质量不产生影响[7]。干燥一步，《中国药典》2015版规定龙胆饮片水分不得超过9.0%，应随时关注、控制样品中水分，不超过药典标准且不过度干燥[19-20]。

综上所述，在龙胆饮片生产过程中，以龙胆苦苷和水溶性浸出物为主要指标，龙胆品质受干燥因素影响较大，具体原因尚不明确，有待进一步探究。本研究在已完成龙胆饮片炮制生产优化的基础上完成，对实际生产中把握生产进程、控制产品质量有一定实际应用意义，也可为其他炮制方法相似的药材提供实际生产方面的参考。