大刺鳅不同组织乳酸脱氢酶及酯酶同工酶研究

徐先栋，王海华，李燕华，吴 斌，马本贺，曾庆祥

（1. 江西省水产科学研究所，江西 南昌 330039；2. 赣州市水产研究所，江西 赣州 341199）

大刺鳅（Mastacembelus armatus），属于鲈形目 （Perciformes）[1]，也有学者通过分子标记分类鉴定结果， 认为大刺鳅属于合鳃目[2-3]，刺鳅科（Mastacembelidae）、刺鳅属（Mastacembelus），俗称辣锥、石锥、刀鳅、粗麻割、镰刀鱼等，主要分布于我国东南地区，是一种小型淡水鱼类，栖息于有石块的江河底层，或岸边有水草的深潭石缝处[4]。其肉质鲜美，富含氨基酸和矿物元素[5]。该鱼因其外观特殊，体表有棘刺，原来不受市场重视，关注较少，近年来，随着人们对该物种认识的不断提高，加上其本身肉嫩味佳，无肌间刺，而且营养价值高，深受消费者喜爱，其良好的市场开发价值日益得到体现。目前对大刺鳅的遗传生物学如核型、线粒体遗传多态性等有少量的报道，如李芬等[6]对属珠江水系干流的北江大刺鳅核型及线粒体基因的遗传多样性进行了研究，对大刺鳅的同工酶研究目前鲜见报道，为此笔者采集江西省信丰县桃江水域大刺鳅进行了同工酶研究，旨在丰富大刺鳅的遗传生物学数据，为大刺鳅的种质资源保护以及开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用大刺鳅采自江西省信丰县桃江水域。鱼体体长约25 cm，体重55 g 左右，充氧运输至实验室，并在玻璃缸中充气暂养，缸底放置直径为5 cm，长度为30 cm 的聚乙烯管，为大刺鳅提供栖息和隐蔽场所，每天投喂鲜活小杂鱼一次，暂养一周后，鱼状态正常，采样试验。

1.2 试验方法

1.2.1 酶液提取 取大刺鳅肝脏、脾脏、肌肉、肾脏、心脏和脑6 种组织少许，双蒸水冲洗干净，滤纸吸干表面水分，置于离心管中，按1 ∶3（W/V）加入0.1 mol/L 的磷酸缓冲液（pH 值7.0），首先使用消毒后的手术剪把组织剪成小块，然后再使用电动研磨器冰浴研磨成匀浆状。完成后于4℃下10 000 r/min 离心30 min，吸取上清液，-20℃储存，尽快用于电泳分析。

1.2.2 电 泳采用垂直平板不连续聚丙烯酞胺凝胶电泳法，电泳系统为NuPAGE Bis-Tris蛋白预制胶套装，包括invitrogen Mini Gel Tank 小型电泳槽，NuPAGE 蛋白预制梯度凝胶（浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度为12%）NuPAGE LDS Sample buffer 缓冲液。20 μL 样品与2 μL 指示剂溴酚兰混合一起上样，首先使用80 V电泳至样品压缩成一细线并跑出浓缩胶后，调大电压至120 V 继续进行分离胶电泳，当溴酚蓝的边缘到达凝胶底部时，停止电泳，整个电泳过程约30 min。

凝胶电泳完毕后立即取下，用双蒸水漂洗干净，置于染色液中于37℃染色，染色方法参照国标进 行[7]，染色完成后，用双蒸水漂洗干净，保存于7%醋酸中。用数码相机及伯乐（Bio-Rad）凝胶成像系统 （Gel Doc XR+）拍摄同工酶图谱。

同工酶的命名方法参照徐先栋等方法进行[8]。以向阳极方向泳动最快的编为1 号，依次各酶带分别编为2、3、4……n 号。重复试验2 次。同工酶在各组织中的含量以示意图中条带粗细及颜色深浅来表示，条带粗、颜色深表示酶的含量高。

2 结果与分析

2.1 乳酸脱氢酶酶谱表型

大刺鳅乳酸脱氢酶同工酶共检测到5 条酶带，在肌肉中均能检测到5 条，在肝脏中检测到4 条，在脾脏、肾脏及心脏检测到1 条，脑组织中未检测到乳酸脱氢酶表达（图1）。在肝脏中乳酸脱氢酶表达活性最高。

2.2 酯酶酶谱表型

大刺鳅酯酶同工酶共检测到6 条酶带，在肌肉中检测到4 条，肝脏、脾脏、肾脏和心脏中均检测到2 条，脑组织中检测到1 条（图2）。在肝脏中酯酶表达活性最高，其次为肾脏、脾脏。

图1 大刺鳅不同组织乳酸脱氢酶电泳图谱及酶谱示意图

图2 大刺鳅不同组织酯酶电泳图谱及酶谱示意图

3 讨 论

乳酸脱氢酶（LDH）是研究最早也是比较深入的一种同工酶，它是糖酵解过程中的关键酶之一，在氧气充足的组织中，如心脏中催化乳酸脱氢氧化为丙酮酸，参与三羧酸循环[9]，在厌氧器官组织中，如肝脏、肌肉组织中催化丙酮酸还原为乳酸。研究表明，鱼类LDH 同工酶是由多基因决定的，分布存在明显的组织特异性[10]。LDH 同工酶一般由M 和H 蛋白亚基组成，LDH-M、LDH-H基因表达形成四聚体，从阴极到阳极依次排列为M4（LDH5）、M3H（LDH4）、M2H2（LDH3）、MH3（LDH2）、H4（LDH1）5 种组合方式，表现为5 条酶带[9]。研究在大刺鳅肌肉中检测到LDH5 种同工酶，在其他组织中分别检测到0～3条不等，表明大刺鳅的LDH 同工酶存在明显的组织差异性。在肌肉和肝脏嫌气性组织中酶活最强，表明同工酶催化丙酮酸还原为乳酸的反应占优势，与大刺鳅习性温和，栖息于砾石底的江河溪流中，常藏匿于石缝或洞穴中低氧环境相适应。

另外，在多数二倍体鱼类中，LDH 同工酶表现为M、H 基因编码的M、H 亚基构成的5 条谱带[11]，由此可以推测大刺鳅应为二倍体鱼类。此外，大刺鳅不同组织乳酸脱氢酶中，肌肉组织中5 条带表达稳定，脑组织中无LDH 条带，这2 种组织可作为大刺鳅种质鉴定的标志酶取样部位。

酯酶属于水解酶类，能催化酯健水解，目前酯酶的遗传基础和亚基组成尚无定论，一般认为在硬骨鱼类中EST 是单体或二聚体，由多个基因位点编码，多态现象普遍[12]。研究结果同此结论相似，大刺鳅各组织中酯酶的分布具有多态性。研究大刺鳅酯酶在肝脏中表达活性最强，肾脏次之，同李雅娟等[13]研究黄颡鱼体内酯酶结果相类似。肝脏是重要的解毒器官，主要起解毒作用的就是酯酶，酯酶除了维持细胞正常的能量代谢外，还能水解大量非生理性存在的酯类化合物，认为可能与机体的解毒作用密切相关，大刺鳅肝脏中的酯酶含量丰富，与肝脏的解毒功能是相适应的。肾脏是重要的排泄器官，肝脏分解的有毒物质通过肾脏排出体外，因而与之相适应其酯酶同工酶亦表现出活力强的酶带。肌肉组织功能相对单一，酶谱带表达稳定，如研究大刺鳅肌肉组织中4 条酶带，表达稳定清晰，且不同于其他组织，具有特异性，与LDH同工酶一样，可以作为大刺鳅种植鉴定的标志酶取样部位。