断裂点精确定位在平衡易位胚胎染色体分析中的应用

王珺，苟兴庆，王茜怡，王晓红*，张硕

(1.空军军医大学唐都医院妇产科生殖医学中心，西安 710038；2.复旦大学妇产科医院集爱遗传与不育诊疗中心，上海 200011)

染色体平衡易位的新生儿出生率约为1/2 000，平衡易位是染色体结构异常中最常见的畸变类型[1-2]。平衡易位患者在生育年龄前通常无明显临床症状，但其生殖细胞在减数分裂过程中会大概率产生多种比例的不平衡配子，精子和卵母细胞结合后无法产生正常的二倍体胚胎，从而导致出现反复性流产、胚胎发育停止、胎儿畸形和晚期新生儿缺陷等不良妊娠结局[3-5]。同时，在胚胎发育过程中由于非姐妹染色体单体之间或同一染色体上含有同源序列的脱氧核糖核酸(DNA)分子，DNA分子间/内重新组合形成同源重组，这些同源重组的存在将会对染色体是否易位的判断造成影响。

在过去几年中，有许多学者尝试使用显微切割和二代测序、等位基因映射识别、单体型连锁分析(PGH)双端测序和长读长测序来获得平衡易位断裂点的精确定位，随后通过靶向PCR-Sanger测序技术精准定位到断裂点或基于断裂点的单核苷酸多态性(SNP)位点进行连锁分析，鉴定完全正常的胚胎[6-11]。但是，在高度重复和可变易位区域中确定精确断点仍然不稳定且不准确。

本研究针对两例染色体平衡易位携带同胞兄弟，利用基因芯片测序结合荧光强度比(LRR)、B等位频率(BAF)、PGH和基因型识别两对夫妇、男方母亲及胚胎的染色体结构。该方法尽可能缩小断裂点区域，精确判断染色体拷贝数结果，加之对单体型结果的评判，更准确的筛选染色体完全正常的胚胎，为改进并完善染色体结构变异检测技术提供可能。

资料与方法

一、研究对象

本研究中两对平衡易位携带夫妇(夫妇A、B)来自陕西省空军军医大学唐都医院生殖医学中心。详细家系图见图1。患者夫妇A中的男方(Ⅱ4)为哥哥，患者夫妇B中男方(Ⅱ5)为弟弟，兄弟二人均已婚且婚后4年均未行避孕措施，其双方配偶(Ⅱ3和Ⅱ6)于2018年11月因原发性不孕症就诊。细胞遗传学检查发现，两对夫妇中的女方(Ⅱ3和Ⅱ6)均为原发性不孕症，两对夫妇中的男方(Ⅱ4和Ⅱ5)均为平衡易位携带者，染色体平衡易位均为46，XY，t(14；16)(q24；p13.3)，经男方父母核型验证，兄弟二人平衡易位均为母源变异遗传。该两对夫妇签署了知情同意后进行胚胎植入前遗传学诊断(PGD)，该研究方案得到空军军医大学唐都医院伦理委员会的批准。

Ⅱ3(哥哥妻子)和Ⅱ4(哥哥)为夫妇A；Ⅱ5(弟弟)和Ⅱ6(弟弟妻子)为夫妇B图1 平衡易位家系图

二、促排卵和胚胎培养

两对夫妇均采用短效长方案促排卵，当3个主导卵泡直径≥18 mm时，肌肉注射250 mg人绒毛膜促性腺激(HCG)(艾泽，默克，美国)，36 h后经阴道取卵。获卵后经培养39～40 h行卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)，待胚胎发育到囊胚期116～144 h(D5～D6)根据评估标准Gardner[12]评估胚胎质量，所有胚胎冷冻保存。

三、芯片检测

分别抽取两对夫妇及男方母亲(I2)各5 ml外周血放入抗凝管(三力医用科技发展有限公司)，并严格按照血液和组织抽提试剂盒(DNeasy，QIAGEN，德国)说明书提取DNA。胚胎发育第5天取其滋养外胚层中5～10个细胞置于0.2 ml EP管中，根据胚胎细胞制备试剂盒(REPLI-g Single Cell DNA Library Kit，QIAGEN，德国)说明书裂解细胞，并通过多重置换扩增技术(MDA)进行全基因组扩增(WGA)，在恒温30℃扩增8 h，后在65℃条件下灭活3 min。扩增过程中设置阴阳性对照，其中阴性对照为4 μl胚胎培养过程中的空白培养液，阳性对照为细胞系(GM16457，科里尔医学研究所NIGMS人类遗传细胞库，美国)分离的5～10个细胞。根据芯片检测试剂盒说明书(Illumina HumanKaryomap-12 DNA Analysis Kit，Illumina，美国)对分离的DNA和WGA产物进行处理，采用Illumina Human Karyomap-12芯片V1.0进行检测，再使用Illumina iScan Bead Array Reader对其进行扫描。

四、染色体的拷贝数变异(CNV)分析

采用Genome Studio软件和Karyo Studio软件(Illumina)处理微阵列扫描数据以分析CNV。基于二元高斯分布构建14种LRR和BAF模型，用于识别拷贝数异常的基因组区域[13-14]。在正常样本中，每个位置的离散BAF应该在0、0.5和1(分别对应于0/0、0/1、1/1三种基因型)，LRR应该为0，偏离期望位置则表示拷贝数异常。

五、PGH分析

若平衡易位为遗传型，则以平衡易位携带者的携带型亲本为参考，寻找携带型亲本为纯合基因型、平衡易位携带者为杂合基因型的SNPs，判断出平衡易位携带者的易位单体，同时要满足平衡易位携带者为杂合基因型、其配偶为纯合基因型的SNPs，判断出胚胎是否携带平衡易位；若平衡易位为新发型或胚胎中存在不平衡易位相关的拷贝数变异，可以寻找平衡易位携带者为杂合基因型及其另一半为纯合基因型的有效SNPs，用于确定易位携带链的单体型。

六、精确断裂点

结合CNV、单体型与胚胎基因型三种分析方法，明确易位断裂点所在区域。CNV分析基于Karyo Studio软件分析BAF与LRR的分布来确定CNV断点；PGH基于家系中有效SNPs进行分型，不能正确分型的区域则考虑可能存在CNV；存在拷贝数异常的胚胎，其缺失区域内位点应该完全为纯合基因型。综合以上多方面的指标，分析各胚胎的断裂点区域，并确定染色体结构为不平衡易位型(指在易位相关染色体存在CNV)、易位携带型(指易位相关染色体不存在CNV，但其为平衡易位携带者)或正常型(指易位相关染色体结构正常，不携带平衡易位)。

七、胚胎植入与产前诊断

综合评估两对夫妇所有胚胎的单体型结果、染色体结果和胚胎形态学结果(囊胚期胚胎评估标准参考Gardner[12]标准)，优先选择染色体正常型且形态学评分较高(4AA>4AB>4BA>4BB，若滋养外胚层和内细胞团细胞数目较少，胚胎质量评分由“4BB”降为“4B-B-”)的胚胎复苏，经知情同意分别植入母体，于孕中期(17～22+6周)，行羊水穿刺胎儿染色体G显带核型分析，再次确认PGH胚胎检测结果。

结 果

一、促排卵结局

在采用短效长方案促排卵后，夫妇A中的女方(Ⅱ3)共获卵15枚，ICSI后正常受精13枚，达到活检标准胚胎6枚(1-1、1-3、1-5、1-6、1-7和2-2号胚胎)；夫妇B中的女方(Ⅱ6) 获卵14枚，ICSI后正常受精12枚，达到活检标准胚胎9枚(1、2、3、4、5、7、8、9和10号胚胎)，对活检合格的胚胎进行PGH检测并冻存。

二、精确平衡易位断裂点

1.CNV分析结果：平衡易位携带者中14号染色体的断点约在chr14：70 000 000(±3 Mb)附近。其中，染色体正常拷贝数为2，夫妇A中有2枚胚胎(1-1和1-7号胚胎)在平衡易位相关的14号染色体断点下游拷贝数为3，有1枚胚胎(2-2号胚胎)在14号染色体断点下游拷贝数为1；夫妇B中有1枚胚胎(1号胚胎)在平衡易位相关的14号染色体断点下游拷贝数为3；有3枚胚胎(8、9和10号胚胎)在平衡易位相关的14号染色体断点下游拷贝数为1；另外，夫妇A的1-5号胚胎在10号染色体出现新发的拷贝数异常，拷贝数为3，夫妇B的4号胚胎在15号染色体出现新发的拷贝数异常，拷贝数为1(表1)。

表1 胚胎CNV分析结果

分析14号染色体拷贝数BAF分布发现，在拷贝数异常区域(黄色标记)，染色体拷贝数为3的胚胎(1-1、1-7和1号胚胎)的拷贝数异常区域BAF主要离散分布在0、0.33、0.66和1附近(图2A)；染色体拷贝数为1的缺失胚胎(2-2、8、9和10号胚胎)的拷贝数异常区域BAF主要离散分布在0和1附近(图2C)；分析14号染色体拷贝数LRR分布发现，染色体拷贝数为3的胚胎的拷贝数异常区域相较于拷贝数正常区域LRR升高，由于受基因组GC含量、基因组复杂度及芯片荧光信号的饱和度影响，LRR升高不太明显(图2B)；染色体拷贝数为1的胚胎的拷贝数异常区域相较于拷贝数正常区域LRR降低(图2D)。

2.单体型连锁分析(PGH)结果：分别以夫妇A的1-3号胚胎、夫妇B的2号胚胎为参考，在该断点±3 Mb做PGH。夫妇A的PGH发现，1-1、1-7和2-2号胚胎从断裂点位置P点(chr14：69 757 189)开始，父源链的点分布出现颜色交叉现象(胚胎中父源链颜色与参考胚胎父源链颜色相同表示来自同一条链，相反则表示来自不同链，提示存在同源重组的可能)，即为拷贝数异常区域；夫妇B的PGH发现，1、8、9和10号胚胎从断裂点位置P点(chr14：70 880 373)开始，父源链的点分布出现颜色交叉(图3)。综合PGH结果，判断14号染色体断裂点在chr14：69 757 189上游。

3.基因型分析结果：基因型分析发现，chr14：69 757 189上游区域中距离其最近的符合孟德尔遗传定律且基因型为杂合的位点位于chr14：69 340 569，表示断点位于chr14：69 340 569下游；下游中距离chr14：69 340 569最近的不符合孟德尔遗传定律的纯合型位点位于chr14：69 752 603，表示断点位于chr14：69 752 603上游(表2)。

结合CNV、PGH及基因型分析，我们最终可推测该平衡异位的14号染色体的断点位置在chr14：69 340 569～69 752 603之间，范围大小约412 Kb。

三、植入前遗传学检测(PGD)结果

PGH分析以男方母亲(I2)为参考，则需要选择携带者母亲基因型为纯合、兄弟二人基因型为杂合的位点分别构建单体型。兄弟二人中的易位携带链，则可根据链的颜色判断胚胎的来源链。14号染色体断点区域与16号染色体断点区域的颜色均与参考链颜色相反时，即为正常型胚胎；与参考均相同即为易位携带型胚胎；一条颜色相同，另一条颜色相反时则为不平衡易位型胚胎。

夫妇A的1-3和1-6号胚胎在14q24.1断裂点区域与16p13.33断裂点区域颜色与参考链相反，均为正常型胚胎，可优先移植；1-5号胚胎在14q24.1断裂点区域与16p13.33断裂点区域颜色与参考链相同，为遗传性易位携带型胚胎，同时1-5号胚胎在10号染色体存在新发CNV异常，故不可移植；1-1、1-7和2-2号胚胎在14q24.1断裂点区域与16p13.33断裂点区域，其中一条链颜色与参考链相反，另一条链颜色与参考链相同，则为不平衡易位携带型胚胎，故不可移植(图4A、图4B和表3)。同理，夫妇B中2、3、5和7号胚胎为正常型胚胎，可优先移植；1、8、9和10号胚胎为不平衡易位携带型胚胎，故不可移植；其中4号胚胎单体型虽为正常型，但其15号染色体存在新发CNV异常，故不可移植(图4C、图4D和表3)。

A：染色体拷贝数为“3”的胚胎的BAF分布；B：染色体拷贝数为“3”的胚胎的LRR分布；C：染色体拷贝数为“1”的胚胎的BAF分布；D：染色体拷贝数为“1”的胚胎的LRR分布；蓝色为拷贝数正常区域；黄色为拷贝数异常区域图2 胚胎14号染色体BAF和LRR分布图

A：夫妇A；B：夫妇B；男方两条链以红色和蓝色表示；女方两条链以黄色和绿色表示图3 PGH图

表2 胚胎断点区域SNP位点基因型分析结果

(续表)

A：夫妇A和各胚胎14号染色体；B：夫妇A和各胚胎16号染色体；C：夫妇B和各胚胎14号染色体；D：夫妇B和各胚胎16号染色体；男方两条链以红色、蓝色表示，女方两条链以黄色、绿色表示图4 平衡易位相关染色体的PGH分析图

表3 胚胎PGH分析结果

四、临床妊娠结局

综合胚胎形态学评估，夫妇A和夫妇B最终分别选择胚胎等级均为4BB的1-3号和5号囊胚期胚胎单囊胚植入母体。分别在孕18周时进行羊水穿刺，产前诊断结果与胚胎检测结果一致，胎儿并无染色体异常，均于2019年12月足月顺利分娩正常婴儿。

讨 论

SNP芯片是通量较高、使用范围较广的分析染色体拷贝数的平台，它能有效提高染色体拷贝数的检测精度，在一定范围内增加样本数无需额外的费用，亦可反复使用从而提高异常染色体的检出效率[15-17]。本研究中应用的胚胎植入前PGH技术就是一种基于SNP芯片的连锁分析PGD技术，其原理是通过对胚胎与其父母、近亲进行全基因组范围内的SNP检测，通过SNP位点进行家系 PGH，然后通过对染色体异常的胚胎进行断裂点定位，从而确定该家系易位染色体的断裂点区域，最后对该区域上下游连锁区域进行分析，确定携带有易位染色体的单体型，进而确定胚胎是否携带了易位的染色单体。与其他用于区分平衡易位的方法不同，PGH技术无需预实验、操作较简单，不仅能检测胚胎的拷贝数变异和易位携带，还能够应用于大部分单基因遗传病的检测，而且其快速的报告周期特点更符合临床需求[18-22]。

PGH检测过程中连锁分析的前提是该区域没有发生同源重组，一般认为上下游5 Mb范围内的同源重组概率较低，遗传距离越近，发生同源重组的概率越低。对于平衡易位或罗氏易位患者，易位断裂点通常为同源重组高发区域，而这些断裂点附近的同源重组通常会给胚胎PGH带来潜在的分析风险，所以断裂点的位置的精确定位有助于保障分析结果的准确性。本研究基于芯片检测技术，提出一种新的有助于精确平衡易位断裂点的分析思路。芯片检测技术一般基于芯片位点LRR和BAF的分布情况进行CNV检测，但是这种简单指标的分析方法通常分辨率不是很高。为了精确易位断裂点，我们结合LRR、BAF、PGH和基因型分析等4个方面对平衡易位断裂点进行精确定位。基于孟德尔遗传定律，家系中正常的二倍体区域可以正常分型，而CNV区域的分型结果通常是错误的。基于这一原则，可根据家系中的分型结果协助精确断裂点。胚胎的位点基因型同样可以帮助确定染色体易位断点范围，比如缺失区域不会存在杂合性位点等。本文中平衡易位患者经CNV结合LRR与BAF指标分析，确定染色体平衡易位断裂点在chr14：70 000 000(±3 Mb)。结合单体型分析结果，缩小断点范围至chr14：69 203 145～69 757 189(554 Kb)。在考虑断点区域位点的基因型与孟德尔遗传定律后，断点范围缩小至chr14：69 340 569～69 752 603(412 Kb)。断点缩小的范围与芯片中位点设计的密度、位点人群频率、家系中有效位点的分布等相关。

本文中的平衡易位染色体为14号染色体长臂和16号染色体短臂末端，核型为46，XY，t(14；16)(q24；p13.3)。由于16号染色体末端拷贝数异常的区域较小，难以明确判断CNV，所以本文只基于14号染色体做出判断。但在各胚胎的PGH过程中，我们同样针对各个胚胎16号染色体的相互之间分型结果与14号染色体是否一致进行了考虑。需要注意的一点是，夫妇B中的8号、9号和10号3个胚胎染色体结构一致，在断裂点上游三者的分型结果即颜色应该相同。但是，从PGH图中可以明显看出断裂点上游区域9号胚胎的颜色(红色)跟其他两者(蓝色)不同，可以推测在9号胚胎距离断裂点很小的区域可能发生了同源重组(图4C)。由于9号胚胎存在CNV，所以很容易被排除在备选胚胎之外，但是如果该重组发生在没有CNV的胚胎当中，则要相当警惕断点的具体位置，因为很可能将单体型结果判断成相反面。本文介绍了PGH用于辅助判断CNV，但是如果拷贝数重复是父亲或母亲一方一条染色体的2个拷贝，这种情况也值得注意，因为通常这种拷贝数异常并不会导致位点的基因型发生变化，进而并不会带来单体型分型异常。本文结合LRR、BAF、PGH和基因型4个方面的生物学信息，可有效定位CNV断裂点。

本研究在常规PGH检测的基础上，结合了易位断裂点精确定位分析，为临床PGH技术的开展提供了新的思路，未来可以推广到更多的临床案例分析中，可以降低因断裂点附近发生同源重组引起分型错误的概率，从而进一步提升PGH技术的准确性。