猪传染性胸膜肺炎病的诊断

冯波

疾病防治

猪传染性胸膜肺炎病的诊断

冯波

（河南省卢氏县动物卫生监督所，河南 卢氏 472200）

2020年6月，卢氏县某养猪场2~4月龄育成猪呈现不同程度的呼吸系统疾病症状，主要表现为咳嗽、体温升高、呼吸困难甚至呈犬坐样喘气等症状;剖检可见腹腔积液、心包与胸壁相粘连、心包腔内有大量黄白色乳糜状浑浊液体等。笔者等从病猪肺脏组织中分离到14株细菌，通过培养特性观察、生化特征检查与血清型鉴定、PCR检测等试验诊断为猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型和5型。本研究为猪传染性胸膜肺炎的防治提供参考。

1 病例诊断材料采集

1.1 诊断材料

1.1.1 样本采集 病料于2020年6月，从某养猪场中病猪体内采取。

1.1.2 主要试剂和仪器 （1）主要试剂：青霉素、庆大霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等，PCR引物(上游引物5'-CGACTTTTAAATCCG-3';下游引物5'AACAAGTTGTTCGCTA-3')、Taq DNA聚合酶(5U/μl)、dNTP、MgCl2、10×buffer购于大连宝生物工程公司，NAD购自北京鼎国生物技术有限公司。（2）主要仪器：各种生化试验发酵管、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板、血清肉汤、巧克力培养基等。

1.1.3 诊断材料 菌株血清型1-15猪胸膜肺炎放线杆菌、待检菌株、大肠杆菌。

1.2 诊断方法

1.2.1 病理学观察 观察心脏、脾脏、肾脏、盲肠等，重点观察肺脏的病变。

1.2.2 细菌的分离与培养 采集发病死亡的猪肺、肝、脾、心包积液，分别接种于鲜血、巧克力、麦康凯琼脂平板，置37℃培养36h，同时再将接种的另一组平板置厌氧罐中，37℃培养36h。

1.2.3 细菌的鉴定 （1）细菌生化特性鉴定：观察该菌对乳糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖等的发酵情况，观察尿素酶试验、靛基质试验和硝酸盐还原试验的结果。（2）药敏试验：对待检分离菌按照常规药敏纸片法进行常规抗菌药物的敏感性测定，以抑菌圈直径大小和抗菌药物敏感实验判定标准，确定待检分离菌的药敏特性。（3）PCR检测：利用实验室已经建立的胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法，对分离的菌株进行PCR扩增，预期扩增的片段大小为650bp。反应体系为50μl，包括10×buffer 5μl，10mmol/L dNTP 4μl，Taq DNA酶0.5μl，25μmol/L上、下游引物各1.5μl，模板DNA 1μl，ddH2O 36.5μl。PCR反应条件：95℃5min，95℃30s，54℃30s，72℃2min，共进行28个循环，最后在72℃10min。然后取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪中观察结果。（4）血清型鉴定：根据培养特性和生化特性鉴定为阳性的菌株，分别接种含5mmol/L NAD和5%小牛血清的LB液体培养基，37℃培养24h，12000r/min离心10min，沉淀用生理盐水洗涤2次，并稀释成100亿个菌/ml，加0.3%的福尔马林，37℃灭活24h。然后与胸膜肺炎放线杆菌抗血清进行凝集反应，以确定分离菌株的血清型。

2 诊断结果

2.1 剖检结果

病猪剖检病变主要在肺脏。病死猪鼻腔有血性泡沫，以纤维素性出血性胸膜肺炎病变为主要特征。心包有淡黄色透明积液，脾脏边缘有大小不等的坏死斑，盲肠、结肠有坏死灶。胸腔中大量血色液体，肺脏呈暗红色，肿大，充血出血。

2.2 病原分离

心包液及肺组织在血平板上培养24 h 均可看到B溶血、直径约0 .5mm 的光滑、隆起的透亮菌落。菌体大小约0.2~0.4µm×0.4~1.0µm。革兰氏染色不定，但多呈革兰氏阴性，单在、成双或链状的球菌或球杆菌。美蓝不易着染。肉汤培养物多呈双或4~8个菌相连的短链状或丝状菌，无运动性。

2.3 培养特性

分离菌为需氧菌，最适温度为37℃，营养要求高，主要在巧克力琼脂平板和鲜血琼脂平板上生长良好。革兰氏染色阴性，呈小球杆状菌，散在排列。随着传代次数的增加，菌体变得略小，形态不典型。在鲜血琼脂平板上培养24~36h，可见针尖大小、圆形、透明、稍凸、边缘整齐、湿润、光滑无黏性，呈β型溶血的菌落。接种血清肉汤经24h培养，呈浑浊生长，无菌膜形成。

2.4 生化特性

在常规发酵管中加入1µg/ml过滤除菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，然后取5株(1~5号)分离菌纯培养物分别接种于生化培养基内，37℃培养48h。结果，5株纯培养菌所表现的生化特性相似(见附表）。

附表 生化反应试验结果

菌株氧化酶触酶尿酶吲哚葡萄糖蔗糖麦芽糖乳糖木糖甘露醇枸橼酸鸟氨酸精氨酸硝酸盐还原 1-++-+++------+ 2+++-+++------+ 3+++-+++----+-+ 4+-+-+++------+ 5+++-+++------+

2.5 药敏试验 试验结果表明分离菌株对痢特灵高度敏感。

2.6 PCR检测结果 用分离到的细菌为模板，均能扩增出与预期大小一致的650bp核酸片段，而大肠杆菌没有扩增出该片段。

2.7 血清型鉴定结果 根据培养特性、生化试验，分离出14株胸膜肺炎放线杆菌，根据凝集反应检测结果，只有2个血清型，其中血清7型8株(57.1%)、血清5型6株(42.9%)。

3 讨论

（1）根据病理剖检、药敏、PCR检测等结果，对本猪场确诊14例病猪患有传染性胸膜肺炎。快速、准确的诊断该病是控制猪传染性胸膜肺炎的关键。PCR方法在诊断上应用最广泛，极大缩短了诊断周期，该方法具有高灵敏度、高特异性、快速、简便的优点，无疑是诊断该病的最佳选择。（2）从药敏试验结果可以看出，分离到的菌株对痢特灵较为敏感。所以，治疗该病时应进行药敏试验，以便选择敏感药物。（3）猪胸膜肺炎放线杆菌有15个血清型，不同国家和地区流行的血清型不同。本养猪场分离的14株胸膜肺炎放线杆菌血清型鉴定结果表明，血清7型和5型为绝对优势血清型。这可能与不同地区种猪或仔猪来源不同有关。由于不同血清型的APP之间缺乏交叉免疫保护作用，所以各地区应该在血清型鉴定的基础上有针对性的制备疫苗，增强免疫预防的效果。

（2020–07–28）

S858.28

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1007-1733(2020)11-0026-02