酶菌联合处理玉米蛋白粉制备高蛋白原料的研究

陈国明 史路路 张家学 齐振雄

(广东海大集团股份有限公司畜牧水产研究中心海大中央研究院农业农村部微生态资源养殖利用重点实验室，广东广州511400)

玉米蛋白粉是玉米湿法生产淀粉的副产物，蛋白质含量约60%，其余约为20%的淀粉和少量酯类、玉米黄素、叶黄素等[1]，具有蛋白含量高、低纤维素、富含维生素B 和维生素E、不含抗营养因子等诸多优点[2]。玉米蛋白粉是一种非全价蛋白质，目前主要用于饲料处理，在水产畜禽上都有较好的应用效果。Arash等[3]试验证明配方中添加一定比例的玉米蛋白粉能有效地改善肉仔鸡的生长性能，饲料中添加12%的玉米蛋白粉，肉仔鸡的体重增长最快。朱磊等[4]研究表明，在黄颡鱼挤压膨化饲料中可以使用6%的玉米蛋白粉，能够维持黄颡鱼的正常生产性能和正常生理功能。程媛媛等[5]研究表明，用5%玉米蛋白粉替代饲料中9.10%鱼粉，配制等氮等能的试验饲料，饲养罗氏沼虾53 d 后，得出5%玉米蛋白粉组虾的生长和饲料利用与对照组无显著差异（P>0.05）。由于玉米蛋白粉中含有一定量的碳水化合物，这限制玉米蛋白粉在高档水产料饲料中的用量。目前国内外大多数的研究主要集中在提升玉米蛋白粉蛋白溶解度和多肽得率，在提高蛋白含量方面的研究较少。本试验从提升蛋白质含量的角度出发，通过以酵母菌、糖化酶、淀粉酶协同处理的方式进行固体发酵，并通过单因素试验、正交试验优化发酵条件，以期提高玉米蛋白粉蛋白与氨基酸含量，制备出一种高蛋白饲料原料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品及菌株来源

玉米蛋白粉：由海维饲料有限公司赠送；酿酒酵母：自制活菌数为150 亿cfu/g 的活性干酵母，菌种来源于海大研究院菌种库；糖化酶和淀粉酶：购于尤特尔生物技术有限公司。

1.1.2 仪器与设备

恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；烘箱（上海精宏实验设备有限公司）；凯氏定氮仪（上海纤检仪器有限公司）；水浴锅（常州国立试验设备研究所）；恒温摇床（太仓市华利达实验设备有限公司）；电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；pH计（上海三信仪表厂）；灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素试验

玉米蛋白粉200 g，料水比为1：0.7，用碳酸钠调pH 值至6.5，糖化酶与底物比为0.4%，淀粉酶与底物比为0.2%，酵母菌接种量0.3%，接种、搅拌均匀后用PE 袋密封包装，置于培养箱中发酵，发酵温度35 ℃，发酵时间24 h。在上述各单因素的基础上，对需要研究的单因素进行不同水平的调整，分别为：糖化酶与底物比（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、淀粉酶与底物比（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、酵母菌接种量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、料水比例（1：0.5、1：0.6、1：0.7、1：0.8）、发酵温度（25、30、35、40、45 ℃）、发酵时间（8、16、24、32、40、48 h）、初始pH 值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5），每组进行3 个平行试验。样品在60 ℃下烘干4 h，粉碎。测定含水量及蛋白质含量，根据蛋白质含量来确定单因素试验的最佳条件。

1.2.2 正交试验

根据单因素试验结果，确定影响较为显著的因素进行正交试验，以发酵后蛋白质含量为指标确定最佳发酵条件。

1.2.3 测定指标及方法

①水分：GB/T 6435—2006饲料中水分和其他挥发性物质含量的测定。

②蛋白含量：凯氏定氮法，按照GB/T 5009.5—2010方法进行测定，结果为风干基础，水分12%(与玉米蛋白粉原料水分保持一致)。

③氨基酸：酸解法，参照GB/T 18246—2000进行测定。

1.2.4 数据处理

结果以“平均值±标准差”表示，数据处理与分析采用Microsoft Excel与SPSS 23.0软件进行。

2 结果

2.1 单因素试验

2.1.1 糖化酶底物比对发酵效果的影响(见图1)

图1 糖化酶底物比对发酵效果的影响

糖化酶能在淀粉链的非还原性末端切开α-1-4键处，也能缓慢切开a-1-6键，把直链淀粉、支链淀粉水解成葡萄糖，供酵母菌生长利用，进而提高蛋白含量。其添加量过少达不到最佳效果，添加过多又会造成资源的浪费。由图1 结果可见，糖化酶底物比为0.1%～0.4%时，发酵后蛋白含量随着糖化酶底物比的加大而增高，继续增大加酶量，发酵后蛋白不再增加。综上可见，选择0.4%的糖化酶底物比最为合适，此时发酵后的蛋白达到73.05%。

图2 淀粉酶底物比对发酵效果的影响

2.1.2 淀粉酶底物比对发酵效果的影响(见图2)淀粉酶能把玉米蛋白粉中的淀粉水解成糊精和糖，与糖化酶搭配使用，强化效果。淀粉酶不同底物比所对应的蛋白变化规律与糖化酶的效果类似，确定最适的淀粉酶底物比为0.2%。

图3 酵母菌接种量对发酵效果的影响

2.1.3 酵母菌接种量对发酵效果的影响(见图3)酵母菌在发酵过程中可以利用淀粉转化而成的糖类，还可以转化成丰富的菌体蛋白，最终达到浓缩蛋白的目的。由图3 可见，酵母菌接种量在0.1%～0.3%时，随着酵母菌接种量的增加，发酵后蛋白含量也随之增加，当接种量达到0.4%以后，蛋白含量不再增加，因此最合适的接种量为0.3%。

图4 料水比对发酵效果的影响

2.1.4 料水比对发酵效果的影响(见图4)固态发酵基质中少量的水分能够溶解菌体生长繁殖所需要的一些营养物质及代谢产物，有利于促进微生物生长，水分过少易导致物料干结而使微生物生长缓慢，而过高又会使发酵基质黏着成团，并且容易使物料感染杂菌、发霉变质。由图4 的结果可见，发酵时的水分越高，发酵后蛋白含量也越高，但差距不大，考虑到发酵后烘干的成本，因此选择1：0.7 的料水比较适合。

2.1.5 发酵时间对发酵效果的影响(见图5)

图5 发酵时间对发酵效果的影响

发酵时间过短，菌的代谢及对糖分的利用还不充分，发酵时间过长又造成资源的浪费，且容易滋生杂菌。由图5可见，发酵24 h内样品的蛋白随着发酵时间的延长而不断增加，24 h 后蛋白含量趋于稳定，发酵24 h时蛋白含量即可达到73%以上，因此发酵24 h较为合适。

2.1.6 温度对发酵效果的影响(见图6)

温度是微生物和酶制剂发挥作用的关键因素之一。温度过高和过低都会影响到最终处理效果。由图6可知，最适的处理温度为35 ℃。在35 ℃处理时，蛋白含量可以提升至72%以上。

2.1.7 pH值对发酵效果的影响(见图7)

图6 温度对发酵效果的影响

图7 pH值对发酵效果的影响

pH 值同样影响着菌的生长与酶的作用。通过不同pH 值发酵试验，得出合适的发酵pH 值范围是6.0～7.0，最适发酵pH 值是6.5，发酵后蛋白含量达到73%，当pH 值偏酸或偏碱时，发酵后蛋白含量相对较低。

2.2 正交试验

在单因素试验的基础上，选定了糖化酶底物比、淀粉酶底物比、发酵温度、发酵时间4 个因素，采用L9（34）正交试验进行最佳发酵条件的研究，以发酵后的蛋白含量为考察指标。

由表2 正交试验分析，比较各因素对蛋白含量的极差大小及平均值，可知不同参数对蛋白含量影响由大到小为RA>RC>RB>RD，其中糖化酶的底物比对发酵的影响最显著，得出发酵的最优因素组合为A3B2C2D2，即最适合添加量组合是糖化酶0.4%、淀粉酶0.2%、发酵温度35 ℃、发酵时间24 h。在此条件下对最优条件进行试验验证，得到蛋白含量为73.08%。

2.3 发酵前后氨基酸的变化(见表3)

表1 正交试验因素水平

表2 正交试验结果

糖化酶、淀粉酶与酵母菌联合发酵后氨基酸含量的变化较大，发酵后总氨基酸含量由62.61%提高至76.61%，提高了22.36%，不同的氨基酸都有一定程度的含量提升，尤其是必需氨基酸，除色氨酸和赖氨酸外，其他6种氨基酸提升率都达到20%以上。

3 讨论

玉米蛋白粉中含有15%～21%的淀粉，通过复合酶与微生物的联合作用，进行一系列的降解与转化，最终达到蛋白浓缩的目的。本研究以密封厌氧发酵的方式进行发酵，不需要另外控制发酵环境的湿度，避免发酵过程水分的损失而影响酶解效果，另外酵母菌属于兼性厌氧菌，也可以在厌氧环境下生长。通过添加糖化酶与淀粉酶可以将玉米蛋白粉中的淀粉水解，水解得到的糖类再被酵母菌代谢利用，进而可以浓缩提高蛋白含量，优化发酵条件后得到蛋白含量73%以上、氨基酸含量76%以上的高蛋白饲料原料。尽管通过酶解或微生物发酵可以全面提升玉米蛋白粉的水解度、蛋白、氨基酸等指标，但是发酵后的赖氨酸和色氨酸仍然较低，使发酵玉米蛋白粉作为高蛋白饲料原料受到一定的限制。目前的研究主要是通过添加游离氨基酸或与其他蛋白源来混合使用，饶春凤等研究玉米蛋白粉替代鱼粉对凡纳滨对虾生长的影响，得出饲料中补充赖氨酸和蛋氨酸，可提高玉米蛋白粉在凡纳滨对虾饲料中的替代比例，其替代鱼粉蛋白比例可以提高到15%，占饲料比例的4.5%[6]。在必需氨基酸方面，玉米蛋白粉所含氨基酸总量大于大豆粉和鱼粉，其中总含硫氨基酸和亮氨酸含量高于大豆粉和鱼粉，但赖氨酸及色氨酸含量较低，可与大豆粉和鱼粉的蛋白源相互补充[7]。尽管对于水产动物能否能真正利用游离氨基酸还存在争议，但是在玉米蛋白粉饲料中添加游离氨基酸起到了比较积极的效果[8]。因此，怎样改善氨基酸营养价值，怎样与其他蛋白源科学搭配互补，仍然是发酵玉米蛋白粉值得探讨之处。

表3 发酵前后氨基酸含量的变化（风干基础，%）

4 结论

本试验以提升蛋白，制备高档水产饲料的高蛋白原料为出发点，以糖化酶、淀粉酶与酵母菌联合进行玉米蛋白粉密封厌氧固体发酵，通过单因素试验与正交试验，得出最佳发酵条件为：糖化酶底物比0.4%、淀粉酶底物比0.2%、酵母菌接种量0.3%，料水比1：0.7、温度35 ℃、起始pH 值6.5、密封发酵时间24 h，发酵及酶解处理后样品的蛋白提升至73.08%，提高21.80%，总氨基酸与总必需氨基酸分别提高22.36%、23.60%。