SAMC在体内环境下通过干预MAPK与NF-κB信号通路发挥对乳腺癌的治疗作用

陆 娟 冯晨露 赵旭林

乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤之一。尽管中国女性乳腺癌的发病率及死亡率在全球范围内处于较低水平，但流行病学表明，国内女性乳腺癌的发病率呈现迅速上升的趋势，且发病年龄逐渐年轻化[1]。近年来，随着对传统中药研究的不断深入，越来越多的植物活性成分被发现。研究表明，大蒜素具有抗菌消炎、抗氧化以及抗肿瘤的作用，其中S-烯丙基巯基半胱氨酸(SAMC)是大蒜素复杂混合物中的主要活性成分之一[2]。有研究发现，SAMC对包括大肠癌在内的多种肿瘤均有抑制作用[3]，但是对乳腺癌的作用不甚明确，相关文献较少。因此，本研究旨在观察SAMC在体内环境下对乳腺癌的抑制作用，并初步探讨其可能的分子机制，为SAMC的临床应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

人乳腺癌细胞MCF-7购自于中国科学院上海细胞库，BALB/c雌性裸鼠购自于广东省医学实验动物中心，SAMC购自于昆明善利生物有限公司。

1.2 人乳腺癌细胞MCF-7的培养

使用DMEM/High Glucose配制细胞完全培养基(含10% FBS、1%青链霉素双抗)，将细胞放置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，每日观察细胞生长状态，约1～2天半量换液一次，待细胞生长至80%接触面积时进行传代。

1.3 乳腺癌荷瘤裸鼠模型的建立

人乳腺癌细胞MCF-7培养于细胞完全培养基中，取处于对数生长期的细胞，0.25%胰蛋白酶消化液消化，FBS终止消化后离心(1000 rpm、5 min)后去上清，加入生理盐水重悬细胞并计数，制成单细胞悬液，并将细胞密度调整至5×107个/ml，取200 μl细胞悬液接种至裸鼠左侧上肢腋下的皮下，其后每日观察肿瘤直径，将肿瘤直径≥5 mm定义为造模成功。

1.4 实验分组及给药

将造模成功的18只裸鼠随机分为对照组、SAMC低剂量组及SAMC高剂量组，每组6只。对照组给予生理盐水腹腔注射；低剂量SAMC组给予150 mg/kg的SAMC腹腔注射；高剂量组给予300 mg/kg的SAMC腹腔注射。裸鼠饲养于无菌动物房中，每48 h给药一次，共计给药10次。

1.5 肿瘤直径的测量

每隔4天测量一次肿瘤直径，采用游标卡尺准确读数并记录。

1.6 Q-PCR法检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax的转录水平

末次给药结束48 h后，采用脱颈法处死裸鼠并取瘤，PBS清洗后加入Trizol LS裂解液提取总RNA并逆转录为cDNA，设计Bcl-2、Bax基因引物，对各自基因进行Q-PCR扩增并分析结果。

1.7 Western blot检测cleaved Caspase-3、Caspase-3、Bcl-2、Bax、JNK、p-JNK、p38、p-p38、p-IκBα、NF-κB p65蛋白的表达水平

末次给药结束48 h后，采用脱颈法处死裸鼠并取瘤，PBS清洗后加入RIPA组织/细胞高效裂解液进行裂解，超声匀浆后通过低温高速离心机进行离心(4 ℃、12000 rpm、20 min)，小心收集上清后通过BSA法进行总蛋白浓度测定，完毕后加入Loading Buffer煮沸10 min，并置于-20 ℃冰箱中备用。经过SDS-PAGE凝胶电泳、转膜后加入1.5%封闭用牛奶进行封闭，结束后分别加入一抗后4 ℃过夜，TBST洗膜后加入HRP标记二抗，室温下孵育2 h，经过TBST洗膜后通过增强化学发光法进行化学发光，并通过ImageJ软件进行条带灰度值分析。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 SAMC干预对荷瘤裸鼠乳腺癌直径的影响

SAMC干预期间，每隔4天通过游标卡尺测量荷瘤裸鼠肿瘤直径，结果显示：在观察期间，各组乳腺癌瘤体直径均增长。在相同观察时间下，与对照组相比，低剂量SAMC组的肿瘤直径更小(P<0.05)；与低剂量组相比，高剂量SAMC组的肿瘤直径进一步减小(P<0.05)，见表1。

表1 SMAC处理后各组裸鼠瘤体直径

2.2 SAMC干预对凋亡相关基因Bcl-2、Bax转录水平的影响

荷瘤裸鼠腹腔注射给药10次后，Q-PCR法检测SAMC干预后对乳腺癌细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax转录水平的影响。结果显示：给予SAMC干预后，与对照组相比，乳腺癌细胞中抗凋亡基因Bcl-2的转录水平降低，促凋亡基因Bax的转录水平升高(P<0.05)，与低剂量组相比，高剂量SAMC组中这一现象更为显著(P<0.05)，见表2。

2.3 SAMC干预对凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3、Caspase-3、Bcl-2、Bax表达水平的影响

荷瘤裸鼠腹腔注射给药10次后，Western blot法检测SAMC干预后对乳腺癌细胞中凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3、Caspase-3、Bcl-2、Bax表达水平的影响，结果显示：给予SAMC干预后，与对照组相比，乳腺癌细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平降低，促凋亡蛋白Bax、cleaved Caspase-3的表达水平升高(P<0.05)，而对Caspase-3的表达水平无显著影响(P>0.05)与低剂量组相比，高剂量SAMC组中这一现象更为显著(P<0.05)，见表3。

表2 Q-PCR法检测SMAC处理后瘤体的Bcl-2、Bax基因转录水平变化

表3 SMAC处理后瘤体的Bcl-2、Bax、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白表达水平变化

2.4 SAMC干预对MAPK信号通路相关蛋白JNK、p-JNK、p38、p-p38表达水平的影响

荷瘤裸鼠腹腔注射给药10次后，Western blot法检测SAMC干预后对MAPK信号通路相关蛋白JNK、p-JNK、p38、p-p38表达水平的影响，结果显示：给予SAMC干预后，与对照组相比，乳腺癌细胞中MAPK信号通路相关蛋白p-JNK、p-p38的表达水平升高(P<0.05)，而JNK、p38的表达水平无显著差异(P>0.05)与低剂量组相比，高剂量SAMC组中这一现象更为显著(P<0.05)，见表4。

表4 SMAC处理后瘤体MAPK信号通路JNK、p-JNK、p38、p-p38蛋白表达水平变化

2.5 SAMC干预对NF-κB信号通路p-IκBα、p65蛋白表达水平的影响

对荷瘤裸鼠腹腔注射给药10次后，Western blot法检测SAMC干预后对乳腺癌细胞中NF-κB信号通路p-IκBα、NF-κB p65蛋白表达水平的影响，结果显示：给予SAMC干预后，与对照组相比，乳腺癌细胞中NF-κB信号通路相关蛋白p-IκBα、p65的表达水平降低(P<0.05)，与低剂量组相比，高剂量SAMC组中这一现象更为显著(P<0.05)，见表5。

表5 SMAC处理后瘤体的NF-KB信号通路p-Iκbα、p65蛋白表达水平变化

3 讨论

随着对中国传统药物研究的不断深入，天然植物提取物的相关研究是当前的热点之一。大蒜素是1种从百合科植物大蒜的鳞茎中所提取出来的含硫天然混合物，主要包括二烯丙基硫化物、二烯丙基等化合物[2]。现有的研究表明，大蒜素具有抑制多种肿瘤细胞的增殖并且促进其凋亡的作用[4]。S-烯丙基巯基半胱氨酸(SAMC)作为大蒜素中的主要成分之一，对结肠癌、骨肉瘤以及腺样囊性癌细胞具有明显的抑制增殖与促凋亡作用[5]。本研究通过建立乳腺癌的荷瘤裸鼠模型，腹腔注射给予不同剂量的SAMC进行干预，观察SAMC在体内环境下的抗乳腺癌作用，并探讨其发挥作用的可能的分子机制。本研究结果显示，SAMC组的肿瘤直径明显小于对照组，说明SAMC对肿瘤生长具有明显的抑制作用；于此同时，SAMC高剂量组的肿瘤直径小于SAMC低剂量组，说明SAMC在作用于肿瘤时，作用效果与剂量呈正相关。

细胞增殖与凋亡之间的失衡是肿瘤发生的重要原因之一，因此，对肿瘤细胞凋亡的调控是治疗肿瘤的重要途径之一[6-7]，Bcl-2与Bax之间的平衡对药物调控肿瘤细胞凋亡水平具有重要意义[8]。Casepase-3在细胞凋亡的过程中发挥重要作用，Caspase-3被剪切后形成cleaved Caspase-3从而发挥导致肿瘤细胞凋亡的功能。为了进一步研究SAMC抑制肿瘤的作用机制，我们通过Q-PCR与Western blot检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax的基因转录水平与cleaved Caspase-3、Caspase-3、Bcl-2、Bax的蛋白表达水平。在本研究中，我们通过给予荷瘤裸鼠SAMC腹腔注射，观察药物干预后对裸鼠皮下乳腺癌组织中凋亡相关基因的转录水平与相关蛋白的表达水平，结果显示：SAMC作用于乳腺癌荷瘤小鼠后，能够显著抑制肿瘤细胞中Bcl-2的基因转录水平与蛋白表达水平，并且能够明显促进Bax的基因转录、蛋白表达，同时能够促进Caspase-3的活化，进而促进肿瘤细胞的凋亡，发挥抑制乳腺癌生长的作用；此外与低剂量组相比，高剂量SAMC组中Bcl-2的表达水平更低，Bax的表达水平与Caspase-3的活化水平更高，提示给予荷瘤裸鼠高剂量的SAMC能够进一步促进乳腺癌细胞的凋亡，更好地发挥其抗肿瘤作用。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一类丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，在接受到细胞因子、激素、神经递质等刺激后能够被激活，从而将信号转移至细胞核内[9]，其中P38通路与JNK通路与肿瘤的关系十分密切。p38通路可通过激活p53、诱导Bax转位以及参与Fas/FasI介导的凋亡发挥促进肿瘤细胞凋亡的作用[10-14]；而JNK通路参与调控Bax、CytC、Fas/FasI、Caspase-3等凋亡相关因子，实现对肿瘤细胞凋亡的调控[15-17]。因此，本研究试图通过观察SAMC作用于荷瘤裸鼠后，乳腺癌组织中MAPK信号通路相关蛋白JNK、p-JNK、p38、p-p38的表达情况，阐明SAMC促进乳腺癌细胞凋亡的分子机制。结果表明，经过SAMC干预后，乳腺癌组织中p-JNK、p-p38的表达水平显著升高，且高剂量SAMC组与低剂量SAMC组相比蛋白表达水平升高更为明显，而SAMC对JNK及p38蛋白表达无明显影响。这一结果表明，SAMC作用于荷瘤裸鼠后，通过激活MAPK信号通路中的P38与JNK通路，发挥促进乳腺癌细胞凋亡的作用。

NF-κB信号通路与炎症反应以及肿瘤的发生具有十分密切的关系[18-21]，在本研究中，我们发现，SAMC作用于荷瘤裸鼠后，能够显著抑制IκBα的磷酸化，进而阻止NF-κB的转录和表达。此外，SAMC还能够直接抑制NF-κB p65的活性，从而抑制乳腺癌细胞的基因转录活性，以达到抑制肿瘤细胞的目的。且与低剂量SAMC组相比，高剂量SAMC组中IκBα的磷酸化水平与NF-κB p65的表达水平更低，说明SAMC在体内环境下对NF-κB信号通路的抑制作用具有明显的剂量依赖性，其作用效果与SAMC剂量呈正相关。

综上所述，本研究发现SAMC在体内环境下能够通过激活MAPK信号通路同时抑制NF-κB信号通路，进而促进乳腺癌荷瘤裸鼠体内肿瘤细胞的凋亡，从而达到抑制肿瘤生长的目的，且这一作用效果与药物剂量呈正相关。作为植物提取物大蒜素中的主要成分之一，SAMC在治疗肿瘤性疾病尤其是乳腺癌方面具有非常广阔的前景，希望能够通过本研究，为SAMC应用于临床提供实验基础与理论依据。