右美托咪定鞘内注射对移植胃癌细胞株MGC-803大鼠行为能力的影响

陈祖涛 彭会丽 韩 俊 徐 扬

右美托咪定是α2-肾上腺能受体激动剂，可选择性高效激活中枢α2-肾上腺素受体，发挥镇痛、抗交感以及镇静效果，已经成为了一种常用的手术麻醉药物和危重患者镇静药物[1-2]。已有研究显示右美托咪定进入体内能够通过释放miRNAs等生物活性物质，减轻组织损伤程度，促进受损组织的修复[3]；特别是右美托咪定对机械通气所导致的大鼠肺损伤模型中炎症细胞因子的表达有移植作用，从而减轻肺损伤[4-5]，但是对移植瘤的作用鲜少报道。本文具体探讨了右美托咪定鞘内注射对移植瘤大鼠行为能力的影响，以明确右美托咪定的作用效果与机制。现总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究材料

TUNEL染色试剂盒购自BD公司，抗Beclin-1抗体(稀释度1∶1000)、抗LC3抗体(稀释度1∶2000)购自美国CST公司，TNF-α与IL-6检测试剂盒购自上海生工公司，盐酸右美托咪定注射液购自江苏恒瑞公司。

18只雄性Wistar大鼠[周龄(12±1)w、体重(320±20)g、SPF级]购自常州卡文斯实验动物有限公司，编号20914244，研究得到了实验动物伦理委员会的批准，严格按照动物福利饲养动物。

1.2 移植瘤模型建立

选用胃癌细胞株MGC-803，复苏后进行传代培养，收集对数生长期MGC-803细胞，将细胞浓度调整为1×108个/ml，在每只大鼠左腋下注射0.2 ml MGC-803细胞，观察大鼠致瘤情况。建模完成以肿瘤大小≥0.1 cm2为准。

1.3 大鼠麻醉方法

将所有移植瘤模大鼠分为3组：对照组、实验1组与实验2组，每组6只大鼠。实验1组与实验2组大鼠进行腹腔麻醉，注射8%水合氯醛(350 mg/kg)，建立完整的静脉通路，根据大鼠的生命体征及肌肉松弛状态调整水合氯醛静脉滴注速度。实验2组给予右美托咪定鞘内注射预处理，再注射水合氯醛给予鞘内注射右美托咪定2.5 μg/kg。实验1组以等剂量的生理盐水代替。对照组不进行腹腔麻醉，都以等剂量的生理盐水代替。

1.4 观察指标

(1)在给药后1周与2周按照Tarlov评分标准评定大鼠的行为能力，分为0～4分，分数越高，行为能力越好。(2)给药后2周将所有大鼠处死，将移植瘤取出并称重，记录与计算大鼠的移植瘤重量和抑瘤率。(3)取大鼠的移植瘤标本，甲醛固定后石蜡包埋，制成切片，切片厚度为4 μm，采用TUNEL法检测与计算细胞凋亡指数。(4)充分研磨大鼠的新鲜移植瘤组织，过滤，提取移植瘤中的总蛋白，采用Western bolt法检测Beclin-1、LC3的表达情况。(5)取大鼠处死后的血液1 ml左右，静置10 min后，3 000 rpm/min离心10 min，取上层血清，采用免疫组化法检测TNF-α与IL-6含量。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠行为能力评分对比

给药后1周与2周，实验2组的Tarlov评分都显著高于实验1组与对照组(P<0.05)，实验1组与对照组对比差异也有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 3组大鼠行为能力评分对比(分，

2.2 移植瘤重量和抑瘤率的比较

与对照组相比，实验1组、实验2组的移植瘤重量显著降低(P<0.05)，抑瘤率显著增加(P<0.05)；实验1组与实验2组对比差异也有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 细胞凋亡指数对比

实验2组、实验1组的移植瘤细胞凋亡指数分别为(30.67±4.14)、(21.74±3.13)，都显著高于对照组的(3.13±0.24)(t=16.267、t=14.521,P均<0.05)；3组对比差异也有统计学意义(F=31.842，P=0.001)。

2.4 Beclin-1、LC3蛋白表达对比

与对照组相比，实验2组、实验1组移植瘤的Beclin-1、LC3相对表达量显著增加(P<0.05)，实验1组与实验2组对比差异也有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表2 3组移植瘤的重量和抑瘤率的比较

表3 3组移植瘤的Beclin-1、LC3蛋白表达对比

2.5 血清TNF-α与IL-6含量对比

与对照组相比，实验2组、实验1组的血清TNF-α与IL-6值显著降低(P<0.05)，实验1组与实验2组对比差异也有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 3组血清TNF-α与IL-6含量对比

3 讨论

当前我国胃癌的发生率逐年增加，每年有近30万人死于胃癌，另有约40万新发病例。当前胃癌的诊断和治疗技术在进步，但是很多患者在就诊时仍处于晚期，预后比较差[6]。作为一种α2肾上腺素受体激动剂，右美托咪啶可选择性高效激活α2肾上腺素能受体，具有镇痛、抑制交感神经、镇静以及抗焦虑等作用[7]。近期的研究结果显示右美托咪啶具备抑制蛋白激酶A(PKA)的效果，进而抑制下游蛋白磷酸化，使细胞超极化，产生突触后抑制，并且可以调节致凋亡和抗凋亡蛋白之间的平衡[8-9]。本研究显示给药后1周与2周，实验2组的Tarlov评分都显著高于实验1组与对照组，实验1组与对照组对比差异也有统计学意义；与对照组相比，实验2组、实验1组的移植瘤重量显著降低，抑瘤率与细胞凋亡指数显著增加，实验1组与实验2组对比差异也有统计学意义，表明右美托咪啶的应用能促进大鼠移植瘤细胞的凋亡，提高抑瘤率，从而减轻移植瘤重量，改善大鼠的行为能力。当前也有研究显示右美托咪啶可能在一定程度可以减轻肾缺血再灌注诱发肺损伤，对肺损伤具有一定的保护作用[10-11]。

由于各种因素的影响，当前很多胃癌患者诊断时已经处于进展期，并伴广泛浸润和淋巴结转移，其中自噬机制失调是胃癌转移的初始阶段，也是决定胃癌患者预后的关键因素[12]。自噬发生于真核细胞内，为2型程序性死，其发生过程依赖溶酶体，可高效地降解细胞，是决定肿瘤细胞预后的关键因素[13]。Beclin-1、LC3等的表达与自噬密切相关，胃癌患者体内的Beclin-1基因表达降低，Beclin-1基因缺失和胃癌的发生密切相关，Beclin-1基因表达降低可降低肿瘤细胞自噬水平。LC3蛋白是通用的细胞自噬膜标志物，可定位于自噬泡膜和前自噬泡膜表面，细胞合成的LC3蛋白经过修饰成为LC3-Ⅱ，细胞自噬活性与LC3-Ⅱ的含量成正比，检测LC3-Ⅱ的含量可间接反映肿瘤细胞的自噬能力[14-15]。本研究显示实验2组、实验1组的移植瘤Beclin-1、LC3相对表达量都显著高于对照组，实验1组与实验2组对比差异也有统计学意义，表明右美托咪啶的应用能促进肿瘤细胞的自噬，进而抑制肿瘤生长，主要在于右美托咪定能减少血循环和组织中儿茶酚胺的释放，降低交感神经的兴奋性，抑制应激反应，从而促进肿瘤细胞自噬[16-17]。

右美托咪定除了镇静、抗焦虑和抑制交感神经作用，还具有抗炎作用，能抑制机体的无菌性炎症，防止组织器官进一步被损害[18-19]。本研究显示与对照组相比，实验2组、实验1组的血清TNF-α与IL-6值显著降低，实验1组与实验2组对比差异也有统计学意义，也表明右美托咪啶的应用的能抑制TNF-α与IL-6的表达。本研究也有一定的不足，右美托咪啶的作用通路比较复杂，对移植瘤的影响机制还不明确，可能存在研究偏倚，将在后续研究中深入分析。

综上所述，右美托咪定鞘内注射对胃癌移植瘤大鼠中的应用能抑制TNF-α与IL-6的表达，也能促进肿瘤细胞凋亡与自噬，从而提高抑瘤率与减轻移植瘤重量，改善大鼠的行为能力。