氮添加对不同林龄杨树人工林丛枝菌根真菌群落的影响

胡家欣，彭思利，张栋，葛之葳，杨楠

南方现代林业协同创新中心/南京林业大学生物与环境学院，江苏 南京 210037

氮沉降增加会导致陆地生态系统发生一系列的变化，如土壤酸化、生物多样性（Stevens et al.，2004；Bobbink et al.，2010）和微生物群落结构改变（Mohan et al.，2014），进而影响陆地生态系统生物地球化学循环过程（Matulich et al.，2015）。它是人类面临的全球性问题之一，其引发的一系列环境问题已成为当前国际生态学研究的热点（Janssens et al.，2010）。丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）能与大部分高等植物的根系形成共生关系（Brundrett，2009；宋培玲等，2013），进行重要的物质和能量交换。植物将光合产物以碳源形式传输给AMF，AMF通过其强大的菌丝网络为植物吸收更多的营养物质和水分，参与土壤碳、氮、磷等多种元素的生物地球化学循环（王浩等，2018）。当土壤中氮素含量较低时，植物往往依赖菌根吸收氮素；而当土壤氮素含量增加后，植物自身吸收氮素的成本降低，提供给AMF碳水化合物的成本高于自身吸收氮素消耗的成本，对菌根的依赖性就会减弱，根系侵染受到影响（Carbonnel et al.，2014）。当土壤氮含量改变时，植物与AMF间的博弈关系发生改变，不同类群AMF可能会被选择性地保留或抑制，最终AMF群落结构组成改变，如巨孢囊霉属AMF形成巨大的孢子，孢子萌发需要大量的碳水化合物，其发育易受到抑制；而球囊霉属AMF产生的孢子较小，对光合产物的需求较少（蔺吉祥等，2015），可能会被选择性地保留下来。土壤氮素含量变化对AMF的影响还与土壤养分状况、氮沉降浓度和宿主植物或生态系统类型等因素有关（Treseder，2004；Mohan et al.，2014）。

杨树是典型的丛枝菌根植物（Neville et al.，2002），江苏省是中国杨树人工林分布的主要区域之一。本研究以江苏省东台试验林场杨树人工林为研究对象，基于野外长期模拟氮沉降样地，利用传统染色和高通量测序技术，分析不同氮沉降处理对杨树-AMF共生关系、分泌物和AMF群落结构组成差异及其与环境因子的关系，揭示氮沉降对杨树人工林丛枝菌根真菌群落的影响，为氮沉降增加背景下杨树人工林养分循环等生态过程研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验样地位于江苏省盐城市东台林场（120°07′—120°53′E，32°33′—32°57′N），杨树人工林占地面积达 2000 hm2，属北亚热带季风气候，年均气温14.6 ℃，相对湿度为88.3%，无霜期为220 d，平均日照时数为2169.6 h，年太阳辐射总量为493.5 J·cm-2，年均降水量 1059.8 mm。地处长江中下游冲积平原，土质为砂质壤土，弱碱性。

1.2 试验设计与样品采集

试验样地设立于2012年5月，采用人工施氮模拟大气氮沉降。选择2007年（11 a）和2003年（15 a）营造的杨树（黑杨派无性系 I35，Populus deltoidesCL‘35’）人工林，设置3个重复样地（样地大小为20 m×90 m）。采用随机区组设计，每个样地设置5个氮水平样方（样方大小为10 m×20 m），每个样方之间设置10 m的缓冲带。参照该地区大气氮沉降量 6.3—12.6 kg·hm-2·a-1（郑丹楠等，2014），设置5个施氮水平，分别为0、5、10、15、30 g·m-2·a-1（以 N 计），即为对照（N0）、低氮（N1）、中氮（N2）、高氮（N3）和超高氮（N4）。2个龄级和5个施氮水平共计30个样方。在样地设立后，每年于杨树的生长季（5—10月）进行5个水平的氮添加处理：将每个处理样方所需的NH4NO3溶解在20 L水中（相当于0.027 mm降水），人工均匀洒入，对照处理喷洒等量的水。

2018年10月，在每个样方中随机选择生长一致的杨树5棵，分别从东南西北4个方向采集根系（选取直径＜2 mm细根）和土壤样品（根际土壤为根系抖落后的土壤，在野外迅速过2 mm筛）。将5棵树的根系和根际土壤分别混合均匀再取样，放入自封袋中，保温箱冷藏带回实验室备用。3次重复，共获得 2(龄级)×5(氮水平)×3(重复)=30 个样品。

根系样品置于0.25 mm的筛子上，自来水下冲洗干净，剪成约1 cm的根段后混匀，取约1 g用于根系侵染率的测定。土壤样品取约 50 g，放入-80 ℃冰箱，用于真菌群落结构的测定；另取约150 g风干，用于土壤基本理化性质的测定。

1.3 土壤理化性质和根系-AMF共生关系的测定

土壤含水率用鲜土烘干法测定；pH值采用玻璃电极法测定（1:5土水比）；土壤总碳（TC）、总氮（TN）使用元素分析仪（Elemental Analyzer，Perkin Elmer 2400 Ⅱ，USA）测定；土壤总磷（TP）和速效磷（AP）测定采用钼锑抗比色法；硝态氮（NO3--N）和铵态氮（NH4+-N）采用紫外分光光度法和靛酚蓝比色法测定（鲁如坤，2000）。根系-AMF共生关系用根系侵染率和 AMF分泌物球囊霉素（Glomalin-related soil protein，GRSP）含量表示；根系侵染率采用网格交叉法测定（McGonigle et al.，1990）；总球囊霉素相关土壤蛋白（T-GRSP）和易提取球囊霉素相关土壤蛋白（EE-GRSP）依据Wright et al.（1998）的方法测定。

1.4 AMF群落结构和多样性的测定

AMF群落结构组成采用Illimina Miseq高通量测序技术测定。称取0.5 g冷冻土样，用Fast DNA SPIN Kit for soil（MP，USA）试剂盒，按照说明书进行总DNA抽提，以Nano Drop 2000进行DNA浓度和纯度的检测；以AML1F/AML2R（Lee et al.，2008）和 AMV4-5NF/AMDGR（Van Geel et al.，2014）进行两轮PCR扩增（ABI Gene Amp® 9700型）。扩增的 PCR产物以 Axy Prep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）纯化后，利用 Quanti Fluor™-ST（Promega，USA）进行定量检测；利用Illumina公司的Miseq PE250平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。将测序后的数据去除非目的序列，再以软件Usearch归类操作，依据序列相似性（相似性水平 97%）归为不同的分类操作单元（OTU），计算AMF群落丰富度指数（Chao指数）和多样性指数（Simpson指数），并根据silva库中的参考序列对OTU进行种属鉴定，在属（genus）和种（species）分类水平统计各样本的群落组成。

1.5 统计分析

运用SPSS 22.0对不同氮添加处理间的各项指标进行单因素方差分析（One-way ANOVA），用多重比较法（LSD）进行差异显著性检验，显著水平为0.05；用Pearson相关系数评价根系-AMF共生关系与土壤理化性质的相关关系；采用R语言vegan软件包对 AMF群落结构进行非度量多维度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS），并采用 ANOSIM 进行差异显著性分析；用冗余分析（Redundancy analysis，RDA）分析AMF群落结构与环境因子的关系，并用Monte Carlo进行显著性检验。最后用Origin 2019作图。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质

不同氮添加水平下杨树人工林土壤理化性质如表 1所示。不同氮添加对土壤 pH和硝态氮（NO3--N）质量分数有显著影响（P＜0.05），而土壤全氮（TN）、全磷（TP）和速效磷（AP）在两个龄级的杨树人工林中均无显著性变化。氮添加显著增加了 NO3--N质量分数，但降低了土壤铵态氮（NH4+-N）质量分数。随着氮添加水平的增加，土壤pH值呈现上升趋势。两种龄级人工林土壤总碳（TC）和碳氮比（C/N比）对氮添加的响应不一致：11 a杨树人工林土壤TC质量分数无显著变化，而15 a的在氮处理间差异性显著，N2处理TC质量分数显著低于其他4个处理；15 a杨树人工林土壤C/N比无显著差异，而11 a的N3处理C/N比比其他几个处理高出3.4—11.9倍。

2.2 根系-AMF共生关系

不同氮添加水平对杨树根系AMF侵染率、土壤总球囊霉素（T-GRSP）和易提取球囊霉素（EE-GRSP）质量分数的影响如图 1所示。氮处理对15 a杨树根系AMF侵染率有显著影响，其中，N1处理根系AMF侵染率显著增加（图1A），表明低浓度氮添加促进了根系-AMF的共生关系。同时，氮处理对土壤球囊霉素质量分数有显著影响（图1B、C）：11 a杨树人工林土壤T-GRSP和EE-GRSP质量分数均在N4处理下达到最大值，且N3与N4之间存在显著性差异，说明超高氮（N4）处理促进了AMF生理代谢活动；在15 a杨树人工林中，N3处理土壤T-GRSP质量分数显著降低，而EE-GRSP质量分数无显著性差异。

将根系AMF侵染率、土壤T-GRSP和EE-GRSP与土壤理化性质进行相关性分析（表2），结果表明：AMF侵染率与土壤速效磷、铵态氮和全氮有较高的相关性，T-GRSP和EE-GRSP均与硝态氮有显著正相关关系（P＜0.05）。

2.3 AMF群落结构和多样性

30个土样经高通量测序，对原始序列进行过滤处理，滤掉低质量序列，共得到有效 AM 真菌序列624181条（10680—24129条，平均每个样品20806条）。对每个样品序列进行随机抽样做稀释曲线（数据未列出），所有样本的稀释曲线在测序量为2000—4000条时已趋于平稳，表明本研究中的土壤样品测序深度足够反映土壤样本中的 AMF群落结构。所有序列分属127个OTU，根据OTU聚类分析的结果，计算AMF群落丰富度（Chao指数）和多样性指数（Simpson指数）。如表3所示，氮处理对两个龄级杨树人工林土壤AMF群落Chao指数和Simpson指数均无显著性影响。

表1 不同氮添加水平下杨树人工林土壤理化性质Table 1 Chemical characteristics of the poplar plantations soils under different nitrogen additions

图1 不同氮添加水平杨树根系AMF侵染率、杨树人工林土壤T-GRSP和EE-GRSP质量分数Fig.1 Root infection rate of AMF, mass fraction of T-GRSP and EE-GRSP in the poplar plantations soils under different nitrogen additions

表2 根系-AMF共生关系与土壤理化性质相关性分析Table 2 Correlation coefficients between root-AMF symbiosis characteristics and the environmental factors

表3 不同氮添加水平下AMF群落丰富度和多样性指数变化Table 3 Variation of soil AMF community richness (Chao index) and diversity (Simpson index) indexes in the poplar plantations under different nitrogen additions

将以上各AMF OTUs序列在97%相似水平进行分类学分析，杨树人工林AMF群落分属8属41种，以球囊霉属（Glomus）为主。在属水平统计不同氮添加水平下AMF群落组成如图2所示。氮添加对15 a杨树人工林土壤中球囊霉属（Glomus）和多胞囊霉属（Diversispora）的丰度有显著影响（P＜0.05），具体表现为：N1处理球囊霉属（Glomus）的相对丰度显著低于其他4个处理（P＜0.05）；与对照组相比，氮添加显著增加了15 a人工林中多胞囊霉属（Diversispora）的相对丰度（P＜0.05），相对丰度比其他几个处理高出2.2—3.8倍。而在11 a杨树人工林中，8个属的相对丰度与其他处理间均无显著性差异。

图2 不同氮添加水平杨树人工林土壤AMF群落在属水平的物种相对丰度Fig.2 Relative abundance of the AMF groups at genus level in the poplar plantations under different nitrogen additions

在种水平统计不同氮添加水平下AMF群落组成如图3所示。氮添加对11 a和15 a杨树人工林土壤中Glomus-group-B-Glomus-GlBb1.2-VTX00055的相对丰度均有显著影响（P＜0.05），其中，15 a人工林中N2处理比其他几个处理高出2—18倍，11 a的N1处理的丰度显著高于其他4个处理。此外，氮添加对15a杨树人工林土壤中Glomus-mosseae-VTX00067、Glomus-Wirsel-OTU14-VTX00137、Glomus-MO-G18-VTX00064、Glomus-group-B-Glomus-lamellosu-VTX00193和Diversispora-MO-GC1-VTX00060的相对丰度有显著影响；对11 a的Glomus-viscosum-VTX00063、Glomus-Wirsel-OTU6- VTX00202和Glomus-sp.-VTX00330的相对丰度有显著影响。N1处理显著增加15 a人工林土壤中Diversispora-MOGC1-VTX00060的丰度（P＜0.05），N2处理显著增加 11 a人工林土壤Glomus-viscosum-VTX00063（P＜0.05）的丰度。与对照相比，氮添加显著降低了15 a人工林中Glomus-mosseae-VTX00067和Glomus-MO-G18- VTX00064的丰度（P＜0.01），但Glomus-group-B-Glomus-lamellosu-VTX00193的丰度在N3和N4处理下达到最大值（P＜0.05）。而在11 a杨树人工林中，Glomus-Wirsel-OTU6-VTX00202丰度在N3处理达到最大值且与其他处理间存在显著性差异。

将不同氮添加处理下杨树人工林AMF群落组成（基于OTUs）进行NMDS排序分析，结果如图4所示。ANOSIM相似性检验结果表明，两个龄级间差异显著（R=0.3073，P＜0.05），不同氮添加处理显著影响AMF群落组成（R=0.2734，P＜0.05），其中，15 a人工林氮添加处理间差异显著（R=0.3141，P＜0.05）。

2.4 AMF群落结构与环境因子相关性分析

图3 不同氮添加水平杨树人工林土壤AMF群落在种水平的物种相对丰度Fig.3 Relative abundance of the AMF groups at specie level in the poplar plantations under different nitrogen additions

图4 不同氮添加水平下杨树人工林土壤AMF群落组成（基于OTUs）NMDS排序图Fig.4 Non-metric multidimensional scaling of soil AMF community compositions (based on OTUs) in the poplar plantations under different nitrogen additions

将不同氮添加处理下杨树人工林土壤AMF群落结构组成（基于OTUs）与8个环境因子（pH、全氮、全磷、全碳、碳氮比、速效磷、铵态氮和硝态氮）进行RDA分析，结果如图5所示。15 a人工林 8个环境因子的解释量为 60.47%，土壤铵态氮、总磷、硝态氮、pH是影响AMF群落结构的主要驱动因素（P＜0.05），第一排序轴主要与土壤铵态氮、总磷有关，它解释了群落变化的22.21%，第二排序轴与硝态氮、pH密切相关，它解释了群落变化的17.26%（图5A）；11 a人工林8个环境因子的解释量为53.67%，土壤pH、硝态氮、铵态氮、C/N比是影响AMF群落结构的主要驱动因素（P＜0.05），第一排序轴主要与土壤pH、硝态氮、铵态氮有关，它解释了群落变化的 24.83%，第二排序轴与 C/N比密切相关，它解释了群落变化的20.06%（图5B）。

3 讨论

丛枝菌根真菌（AMF）与陆生植物形成共生体后，可影响氮素的生物吸收与同化、有机氮矿化、生物固氮、硝化和反硝化，以及氮素淋洗等诸多土壤氮素循环过程（Veresoglou et al.，2012）。氮沉降增加导致的土壤氮素含量变化，将对植物-AMF共生体产生一系列显著影响（Treseder et al.，2007）。本研究中，N1处理显著提高了15 a杨树根系AMF侵染率，表明低浓度的氮沉降有利于AMF生长，促进杨树-AMF共生体形成，这与前人研究结果一致；适度的氮沉降有利于植物-AMF的共生（杨剑宇等，2013），提高AMF侵染率。许多学者认为氮添加后，铵态氮在发生硝化作用过程中会释放出H+致使土壤发生酸化（于天一等，2014），是氮沉降抑制AMF的主要原因。本试验样地土壤偏碱性，土壤中的盐基离子等碱性物质对 H+离子有一定的缓冲作用（胡波等，2015），使土壤pH值保持在弱碱性范围；且土壤pH属于易变指标，温度和降水的差异可能导致土壤中生物活性和土壤含水率的变化，从而导致土壤 pH发生变化（刘广明等，2001），使得本研究中AMF侵染率与pH值没有显著相关关系。此外，杨树能够同时与AMF和外生菌根真菌（EMF）形成共生体，AMF与EMF共存时会发生拮抗作用，EMF的优先定殖会限制AMF的侵染（Duponnois et al.，2003）。因此，在后续研究中，将AMF和EMF侵染状况进行综合研究。

图5 不同氮添加水平下杨树人工林AMF群落组成（基于OTUs）与环境因子RDA分析Fig.5 RDA for soil AMF community compositions (based on OTUs) and environment factors in the poplar plantations under different nitrogen additions

球囊霉素相关土壤蛋白（GRSP）是由AMF产生的一种含金属离子的糖蛋白（Wright et al.，1998；He et al.，2010），能促进土壤团聚体的水稳定性，还可通过刺激微生物的繁殖影响微生物量的变化（王建等，2016）。总球囊霉素（T-GRSP）指示土壤中全部的GRSP，而易提取球囊霉素（EE-GRSP）指示AMF新分泌的部分（黄彬彬等，2019）。GRSP难溶于水，在土壤中性质极为稳定，不易被蛋白酶水解，因此能够在土壤中不断累积（李涛等，2005；王建等，2016）。本研究中 11 a杨树人工林土壤T-GRSP和EE-GRSP均在N4处理下达到最大值，表明GRSP的累积和分泌量都较大（图1B和1C），这可能与这一处理中较高的球囊霉属（Glomus）类群丰度有关。

氮沉降在影响植物-丛枝菌根共生体的同时，还会影响AMF群落多样性和群落组成。一些研究表明（Morrison et al.，2016；Zhang et al.，2018），大气氮沉降对AMF多样性有负面影响，并随着氮沉降速率和持续时间的增加呈现下降趋势。如Santos et al.（2006）在瑞典草地生态系统中的研究发现，施氮降低了AMF多样性。本研究中，氮添加处理对杨树人工林土壤AMF丰富度和多样性指数均未产生显著性影响，这可能与氮添加的年限有关。有研究认为，短期（＜5 a）氮沉降试验对土壤 AMF多样性没有显著性影响（雷学明等，2018），只有长期氮添加使土壤氮累积超过一个临界点时才呈现负面效应（Egerton-Warburton et al.，2001）。本研究是在氮添加6年后进行的，土壤氮累积可能并未达到产生负面效应的临界点。

尽管氮添加对杨树人工林AMF多样性未产生显著影响，但是AMF群落结构组成却有明显的差异（R=0.2734，P＜0.05，图4），这与Jumpponen et al.（2005）对高原草地生态系统的研究结果一致。不同菌根真菌在形态、生活习性和对宿主植物的效益等方面有着较大的差异，对氮添加的响应也会表现出不同（乔枫等，2018）。当宿主植物处于土壤氮素富集状态时，会把更多的光合产物分配到植物的地上部分，由于AMF的生长发育离不开植物为之提供碳源，在氮沉降增加的条件下，对光合产物需求上的较大差异导致不同的AMF类群对氮添加产生不同响应（蔺吉祥等，2015）。本研究中，氮添加显著影响了 15 a杨树人工林土壤中的球囊霉属（Glomus）和多胞囊霉属（Diversispora）AMF的相对丰度，低浓度的氮添加使得球囊霉属相对丰度降低，多胞囊霉属相对丰度增加，AMF群落在种水平的相对丰度也发生明显改变，表明氮添加条件下，AMF群落结构会发生一定的改变。不过，在杨树人工林土壤中，AMF群落结构的改变并没有显示很明确的方向性，这可能与宿主植物和氮添加年限有关，还需深入研究。

氮添加对AMF群落结构的影响主要是间接地通过改变土壤理化性质来实现的。AMF群落结构与环境因子的RDA分析得出，土壤铵态氮、硝态氮、pH、总磷、C/N比显著影响着AMF群落结构组成（P＜0.05，图 5），这与前人的研究结果一致（林昕等，2020）。但是，两种龄级的主要驱动因子不尽相同，土壤铵态氮、硝态氮、pH均显著影响15 a和11 a杨树人工林AMF群落结构，此外，15 a还显受总磷影响，11 a还受C/N比影响，表明不同龄级杨树人工林AMF群落结构对氮添加导致的土壤理化性质改变的响应不同。AMF能帮助植物吸收水分和营养，随着养分供应量的增加，效益与成本的平衡就发生变化，宿主植物对菌根真菌的投资会下降（Johnson et al.，1997；Konvalinková et al.，2017；王庆峰等，2018），进而表现为AMF群落结构的变化。氮添加后，土壤中的养分有效性，特别是氮磷养分状况的变化，是影响杨树人工林 AMF群落结构的重要因素。

4 结论

（1）氮添加对杨树人工林根系 AMF侵染率、总球囊霉素（T-GRSP）和易提取球囊霉素（EE-GRSP）有显著影响（P＜0.05），低氮处理促进了根系-AMF共生关系的形成，而超高水平氮处理促进了AMF生理代谢活动。氮添加处理直接改变了土壤理化性质，其对根系-AMF共生关系的影响主要是间接地通过改变土壤理化性质来实现的。

（2）氮添加对杨树人工林土壤 AMF群落多样性影响不显著，但对AMF群落结构组成有显著影响，15 a和11 a杨树人工林AMF群落结构有显著差异。土壤铵态氮、硝态氮、pH、总磷、ω(C)/ω(N)比是影响杨树人工林AMF群落结构的主要因素。