消渴健脾胶囊中栀子苷的提取工艺优化

朱晓东，张佳佳，王 莹，兰 卫

(1.新疆医科大学乌鲁木齐市中医医院，新疆 乌鲁木齐830011；2.新疆医科大学附属中医医院， 新疆 乌鲁木齐 830002；3.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

消渴健脾胶囊是由葛根、白术、大黄、车前子、茯苓、苍术、茵陈、栀子、丹参、土茯苓、莱菔子、厚朴、木瓜等十三味药材组成的复方制剂，具有健脾燥湿、行气和胃、祛浊化郁的功效。栀子具有利胆、镇痛、降压和抑菌抗炎的功效[1]，其主要成分有栀子苷、栀子苷酸、京尼平等[2]。研究表明，栀子苷具有抑菌[3]、利胆[4]、镇痛[5]、保肝[6]、消炎[7]等作用。

消渴健脾胶囊中的苍术、茵陈、栀子、丹参、土茯苓、莱菔子、厚朴、木瓜等八味药材采用水提取，葛根、白术、大黄、车前子、茯苓等五味药材粉碎。水提取的药材中栀子苷等成分为水溶性，具有较强的生物活性，故以栀子苷含量为提取工艺的评价指标。

作者采用单因素实验和正交实验优化消渴健脾胶囊中栀子苷的提取工艺，以最大程度保留栀子苷成分，从而保证消渴健脾胶囊的药效。

1 实验

1.1 药材、试剂与仪器

葛根、白术、大黄、车前子、茯苓、苍术、茵陈、栀子、丹参、土茯苓、莱菔子、厚朴、木瓜，购自安徽亳州中药材饮片有限公司，经新疆医科大学姚蓝副教授鉴定。

栀子苷标准品(批号：110749-200309)，中国药品生物制品检定所；乙腈，色谱纯，Sigma公司;超纯水。

Agilent 1200-DAD型高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；KQ-200KD型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；AL204型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；HH-S4型数显恒温水浴锅，金坛医疗仪器厂；DL-1型电子万用炉，北京永光明医疗仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 栀子苷标准溶液的制备

精密称取栀子苷标准品0.62 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，得0.062 mg·mL-1栀子苷标准溶液。

1.2.2 栀子苷的提取

称取苍术23.0 g、茵陈23.0 g、栀子13.8 g、丹参23.0 g、土茯苓23.0 g、莱菔子34.5 g、厚朴13.8 g、木瓜34.5 g，加入一定量水浸泡30～60 min，煎煮2次，每次45 min，过滤，合并滤液，即得栀子苷提取液。

分别采用单因素实验和正交实验优化栀子苷提取工艺条件。

1.2.3 供试溶液的制备

将栀子苷提取液浓缩定容至200 mL容量瓶中。取1 mL浓缩液用超纯水定容至10 mL容量瓶中，摇匀，经0.45 μm滤膜过滤后，取续滤液作为供试溶液。

1.2.4 色谱条件与栀子苷含量的测定

色谱柱为Column XB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(15∶85，体积比，下同)，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为238 nm，进样量为10 μL。

分别精密吸取栀子苷标准溶液与供试溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪进行分析，测定栀子苷含量。消渴健脾胶囊按干燥品计算，栀子苷含量不得少于1.8%[8]。 栀子苷标准溶液和供试溶液的高效液相色谱图见图1。

图1 栀子苷标准溶液(a)和供试溶液(b)的高效液相色谱图

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 煎煮时间对栀子苷含量的影响

将药材按加水量10倍加水浸泡30～60 min，分别煎煮30 min、45 min、60 min、90 min，煎煮2次，测定栀子苷含量，结果见图2。

从图2可以看出，煎煮45 min时，栀子苷含量最高。

2.1.2 加水量对栀子苷含量的影响

将药材分别按加水量8倍、10倍、12倍、16倍加水浸泡30～60 min，煎煮2次，每次45 min，测定栀子苷含量，结果见图3。

图2 煎煮时间对栀子苷含量的影响

从图3可以看出，加水量10倍时，栀子苷含量最高。

2.1.3 煎煮次数对栀子苷含量的影响

图3 加水量对栀子苷含量的影响

将药材按加水量10倍加水浸泡30～60 min，分别煎煮1次、2次、3次、4次，每次45 min，测定栀子苷含量，结果见图4。

图4 煎煮次数对栀子苷含量的影响

从图4可以看出，煎煮2次，栀子苷含量最高。

2.2 正交实验结果

以栀子苷含量为评价指标，以煎煮次数(A)、煎煮时间(B)和加水量(C)为考察因素，采取L9(34)正交实验进行栀子苷提取实验，因素与水平见表1，正交实验的结果与分析见表2，方差分析见表3。

表1 正交实验的因素与水平

从表2、3可以看出，以栀子苷含量为评价指标时，直观分析结果显示3个因素对提取工艺影响的顺序为：煎煮次数>加水量>煎煮时间；方差分析显示，煎煮次数对栀子苷含量有极显著性影响，加水量对栀子苷含量有显著性影响，煎煮时间对栀子苷含量无显著性影响。因此，确定最佳提取工艺条件为A2B1C2，即加水量10倍、煎煮2次、每次30 min。

表2 正交实验的结果与分析

表3 正交实验的方差分析

2.3 验证实验

在最佳提取工艺条件下，平行煎煮药材3份，测得栀子苷含量(mg·g-1)分别为0.279、0.286、0.281，平均值为0.282 mg·g-1，RSD值为1.28%。

经过验证实验，现提取工艺与原工艺(加水量10倍、煎煮2次、每次45 min)相比，提取的栀子苷含量相当，无显著差异。现提取工艺煎煮时间短，减少了高温对栀子苷的损耗。

2.4 讨论

煎药用水应选用洁净澄清、无异味、杂质及矿物质含量少的水，一般生活饮用水即可。加水量应视药材的质地、吸水量的多少、煎煮过程中的蒸发量及煎煮后所需的药液量进行综合考虑。加水量过少，药材的有效成分不易煎出；加水量过多则煎煮时间势必延长，使部分成分散失甚至破坏，正如《本草纲目》所云:“剂多水少，则药味不出；剂少水多，又煎耗药力”。实际应用时，一般加水量为将饮片适当加压后，液面高出饮片约2 cm为宜。

中药材大多是干燥品，有效成分多沉积于干涸、皱缩的药材组织内，为了缩短煎煮时间，便于有效成分的煎出，通常煎煮前须加水浸泡30～60 min，煎煮过程中应根据药材的质地和药物的性质，控制火候及时间。一般煎药宜先“武”后“文”，即用大火使药液尽快沸腾， 然后改用小火保持微沸状态30 min[9]。

本实验选择HPLC流动相时，首先采用了曲琰等[10]的条件，流动相为乙腈-水(13∶87)，流速1.0 mL·min-1，检测波长238 nm。然后，采用了贺鹏等[11]的条件，流动相为乙腈-水(15∶85)，柱温40 ℃，流速0.7 mL·min-1，进样量5 μL；康艳萍等[12]的条件，流动相为甲醇-水(25∶75)，流速：泵A 0.25 mL·min-1、泵B 0.75 mL·min-1，检测波长240 nm，进样量20 μL；王谦等[13]的条件，流动相为乙腈-水(10∶90)，流速1.0 mL·min-1，柱温25 ℃；朱慧慧等[14]的条件，流动相为甲醇-水(30∶70)，流速1.0 mL·min-1，柱温25 ℃，检测波长240 nm，进样量10 μL。以上条件都存在不出峰、分离度不达标、色谱图不达标等问题，不适于消渴健脾胶囊中栀子苷含量测定。

本实验确定的色谱条件：色谱柱为Column XB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(15∶85)，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为238 nm，进样量为10 μL。在此色谱条件下，色谱图达标，分离度及理论塔板数良好。

3 结论

消渴健脾胶囊中的苍术、茵陈、栀子、丹参、土茯苓、莱菔子、厚朴、木瓜等八味药材采用水提取栀子苷。以栀子苷含量为评价指标，利用HPLC法测定栀子苷含量，采用单因素实验和正交实验优化栀子苷提取工艺条件。确定优化的提取工艺条件为：加水量10倍、煎煮2次、每次30 min，在此条件下，栀子苷含量为0.282 mg·g-1，正交实验结果与验证实验结果一致。该提取工艺稳定、可靠、可行，可为消渴健脾胶囊中栀子苷含量测定和质量控制提供依据。