影响大孔树脂纯化狼爪瓦松愈伤组织多糖的几种因素研究

李学峰， 韩 璐， 刘懿萱， 徐亚男， 廉美兰， 朴炫春

(延边大学农学院,吉林 延吉 133002)

狼爪瓦松(OrostachyscartilagineaA. Ber)为景天科瓦松属的一种2年生或多年生的草本植物[1]，在我国主要分布于山东、内蒙古、辽宁、吉林、黑龙江等省区，它既具有优异的观赏应用价值，又是一种颇具开发价值的野生花卉[2]。狼爪瓦松含多糖类、黄酮类、酚类、有机酸类以及甾醇类等多种有效成分[3]，具有抑菌、抗病毒、抗氧化、抗癌、降血脂、降血压等药理作用。植物多糖已被认为具有多种药理作用，如清除自由基，降血脂、抗氧化、调节免疫活性、抗突变、抗病毒、抗菌及抗肿瘤等作用，在保健品、药品生产等领域应用越来越广泛[4-7]。同时狼爪瓦松愈伤组织中富含多种有效成分，其中多糖是含量较高的一种。因此，通过对狼爪瓦松愈伤组织中多糖进行提纯来进一步研究其功效及相关产品的开发与生产。

大孔树脂具有多孔结构和材料性质，其吸附分离技术同时兼具机械筛分和化学吸附的特点，干扰因素少，选择性高，可以重复循环利用，多用于黄酮、多糖和多酚等生物活性物质的提纯[8]。杨波等[9]在AB-8和D101大孔吸附树脂分离纯化玉竹多糖研究中发现，D101和AB-8树脂都有利于提高多糖的纯化，刘红梅等[10]在S-8大孔树脂对灰树花子实体多糖酶解液色素吸附的影响的研究中发现，S-8型树脂有利于灰树花子实体的多糖纯化，刘明等[11]在柴达木枸杞果渣中黄酮和多糖的制备工艺研究中发现，HP-20型树脂对柴达木枸杞有很好的多糖纯化作用。由此可见，D101、AB-8、S-8和HP-20这4种型号的树脂均对植物多糖纯化有效。由于狼爪瓦松被过度采摘导致其野生资源越来越少，加上人工栽培体系尚未完善，严重影响着狼爪瓦松的进一步开发和利用。所以，通过生物反应器可在中短期内培养出大量狼爪瓦松愈伤组织，是获取植物原材料的一种有效途径[12-13]。因此，该研究利用大孔吸附树脂法对愈伤组织中的多糖进行纯化，旨在为狼爪瓦松愈伤组织多糖的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

参照张万博[14]的方法进行狼爪瓦松愈伤组织的增殖培养。在25 d后收获愈伤组织，用流水充分冲洗，在45 ℃恒温箱中烘干后作为该研究的试验材料。将愈伤组织干品浸泡在70%的乙醇(料液比为 1∶15)中，60 ℃下冷凝回流1 h后，抽滤，收集滤渣。滤渣再次进行冷凝回流，重复3次。合并滤渣，挥干乙醇后，用100 ℃热水提取1 h，提取3次，将每次抽滤的滤液进行合并，减压浓缩，加入乙醇沉淀离心，即得愈伤组织多糖粗提物，用于之后试验。

1.2 方法

1.2.1 大孔树脂的预处理

将所需的大孔树脂浸泡在95%乙醇溶液中，浸泡24 h 后上柱，并使用95%乙醇溶液充分冲洗树脂柱，再用蒸馏水继续冲洗，直至流出溶液无乙醇味。将处理好的树脂加入4%的盐酸溶液浸泡树脂4 h，之后用蒸馏水冲洗，至流出液体的pH值呈中性。最后使用4%的氢氧化钠浸泡树脂4 h，之后用蒸馏水冲洗，至流出液体的pH值呈中性。

1.2.2 大孔吸附树脂种类的筛选

利用静态吸附法[15]筛选树脂种类。试验用4种大孔吸附树脂(D101、AB-8、S-8和HP-20)购于廊坊麦克森化工建材有限公司(河北，中国)。将狼爪瓦松愈伤组织粗提物用蒸馏水稀释到0.8 mg/mL后，测定其多糖浓度(C0)。将3 g预处理后的大孔吸附树脂树后放入200 mL三角瓶中，加入20 mL(V1)的稀释粗提物(0.8 mg/mL)，使树脂吸附多糖，4 h后抽滤，并测定滤液中多糖含量(C1)。抽滤后的树脂再次置入三角瓶中，加入20 mL(V2)的95%乙醇洗脱多糖。4 h后抽滤，收集滤液，测定多糖含量(C2)。根据测定的多糖吸附率及解吸率，选择出供试验的最佳树脂种类。

吸附率/%= (C0C1)/C0100

解吸率/%=(C2V2) / (C0C1)V1100

1.2.3 进样浓度、进料体积、进料流速的筛选

根据大孔树脂种类试验结果，选用AB-8树脂进行预处理，并注入树脂柱(柱径∶柱高=1∶10)，试验方法如下。

1) 进样浓度筛选试验：将粗提物浓度设置为1.2、1.3、1.4、1.5 mg/mL后，分别进样，进料流速为1 BV/h(BV为树脂柱体积)，进料总体积为2 BV。

2) 进料体积筛选试验：进样浓度设置为(1)中最佳浓度，将进料流速调节至1 BV/h，进料总体积为3.5 BV，每进料0.25 BV收集1次流出液体。

3) 进料流速筛选试验：进料流速分别设置为1、2、3 BV/h，进样浓度为试验1)中最佳浓度，进料体积为试验2)中最佳体积。

所有处理中均收集流出液，减压浓缩并干燥，称取干燥后的多糖0.01 g，用蒸馏水定容至100 mL，测定多糖浓度，判断多糖吸附情况，筛选出最佳处理。

1.2.4 洗脱剂浓度、洗脱剂体积和洗脱流速的筛选

洗脱剂浓度筛选采用静态吸附试验法，以乙醇作为洗脱剂。取3 g预处理的AB-8树脂放入三角瓶中，加入0.8 mg/mL的粗提物20 mL，4 h后抽滤。将抽滤后的树脂再次置于三角瓶中，并加入20 mL不同浓度的乙醇(55%、65%和75%)浸泡4 h后抽滤。收集滤液减压浓缩，用蒸馏水定容至10 mL后测定多糖浓度，判断多糖解吸情况，筛选洗脱剂浓度。

为了筛选洗脱剂体积和洗脱流速，预处理的AB-8树脂上柱后，加入粗提取，进样浓度、进样体积、进样流速均调节为试验1.2.3中筛选出的最佳条件。进样过程结束后，用蒸馏水冲洗树脂柱，直至流出液体无色后，加入55%乙醇进行多糖解吸。

1) 洗脱剂体积筛选试验：洗脱流速调节为1 BV/h，每0.25 BV洗脱剂后进行1次流出液体收集，直至加入3 BV的洗脱剂。

2) 洗脱流速筛选试验：洗脱剂体积调节为试验1)中最佳洗脱剂体积，洗脱流速分别设置为1、2、3 BV/h。

所有处理中，收集流出液体，并进行减压浓缩并干燥，称取干燥后的多糖0.01 g用蒸馏水定容至100 mL，测定多糖浓度，判断多糖解吸情况，筛选出最佳处理。

1.2.5 多糖浓度的测定

参照张青等[16]的方法测定多糖的含量。为了绘制标准曲线，取100 mg干燥的葡萄糖标准品，用蒸馏水溶解定容至100 mL，分别取0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25和1.5 mL用蒸馏水定容至10 mL后，配制成不同浓度。各浓度的葡萄糖溶液1 mL中分别加入1 mL的5 %苯酚溶液和5 mL的浓硫酸，空白对照为蒸馏水，反应30 min后测定490 nm处的吸光值，绘制出葡萄糖标准曲线。

为测定样品溶液中的多糖含量，取样品溶液1 mL依次加入1 mL 5 %苯酚溶液和5 mL的浓硫酸，反应30 min后测定490 nm处的吸光值，根据标准曲线计算多糖含量。

1.2.6 数据分析

所有试验处理均设置3次重复。利用Graphpad Prism 7软件程序，采用邓肯式新复极差法进行多重比较，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 狼爪瓦松愈伤组织粗提物

用5 L气升式生物反应器培养狼爪瓦松愈伤组织，在25 d时可以收获鲜重为700 g的狼爪瓦松愈伤组织，并进行烘干。将愈伤组织干品用蒸馏水提取后可以获得5.5 g粗提物，提取率为17%，对粗提物的活性物质含量进行测定的结果，发现多糖含量为381.0 mg/g。将得到的粗提物用于进一步的多糖纯化。

2.2 大孔树脂种类的筛选

不同种类的大孔吸附树脂对狼爪瓦松愈伤组织多糖吸附和解脱的效果不同。从狼爪瓦松愈伤组织多糖吸附的结果看出，AB-8和S-8树脂对多糖的吸附率明显高于D101和HP-20树脂，吸附率达96%以上，说明AB-8和S-8 2种树脂能够较好地吸附狼爪瓦松愈伤组织多糖。从解吸狼爪瓦松愈伤组织多糖的情况来看，用乙醇作为洗脱剂进行洗脱，结果发现D101和AB-8树脂的解吸率显著高于S-8和HP-20树脂(图1)。综上所述，AB-8树脂的吸附率和解吸率明显高于其它种类的树脂，所以，该研究选用AB-8大孔树脂进行进一步的狼爪瓦松愈伤组织多糖纯化条件的研究。

注：数值为平均值±标准偏差(n=3)。字母表示在0.05水平上差异显著。

2.3 进样浓度、进料体积和进料流速对狼爪瓦松愈伤组织多糖吸附的影响

采用动态吸附法对进样浓度、进料体积及进料流速对大孔树脂吸附多糖的影响进行了研究。当进样浓度为1.3 mg/L时，吸附率显著高于进样浓度1.2、1.4和1.5 mg/L(图2)，说明此浓度树脂可以很好地吸附多糖，因此，选用进样浓度为1.3 mg/mL。在进料体积为0.5～2 BV时，随进料体积的增加流出液中多糖浓度缓慢增加；但进料体积超过2 BV时，吸附率急剧降低(图3)，说明进料体积为2 BV时，树脂吸附多糖的量已接近饱和，继续添加样品，多糖会泄露，会造成样品浪费。进料流速对树脂吸附多糖的影响也很大，流速越高多糖泄露越多，当进料流速为1 BV/h时，流出液中多糖含量显著低于进料流速为2和3 BV/h(图4)。说明1 BV/h进料流速下，树脂可很好地吸附多糖。

注：数值为平均值±标准偏差(n=3)，图中的字母表示在0.05水平上有显著差异。

图3 进料体积对多糖吸附的影响

注：数值为平均值±标准偏差(n=3)，图中的字母表示在0.05水平上差异显著。

2.4 洗脱剂的浓度、体积和流速对狼爪瓦松愈伤组织多糖解吸的影响

以乙醇作为洗脱剂，当洗脱剂浓度为65%时，树脂对多糖的解吸率显著高于55%和75%，说明用65%洗脱剂对树脂进行洗脱时，树脂吸附的多糖可最大程度地解吸下来(图5)。

注：数值为平均值±标准偏差(n=3)，图中的字母表示在0.05水平上差异显著。

进一步采用动态附法对洗脱剂体积和洗脱流速对多糖解吸的影响进行了测定。当洗脱剂体积0.25～1.25 BV时，随着洗脱剂体积的增加，流出液中多糖浓度增加，洗脱剂体积继续增加后，多糖浓度下降，当洗脱剂体积达到2.5 BV时，多糖浓度不再减少，说明2.5 BV的洗脱剂可以最大量地将多糖解吸出来，是较为适宜的洗脱剂体积(图6)。因此，对不同洗脱流速的影响进行调查时，使用洗脱剂体积为2.5 BV。当洗脱流速为2 BV/h时，流出液的多糖高于1和3 BV/h组，说明当洗脱流速为2 BV/h时，对多糖解吸效果较好，因此，选择2 BV/h为最佳的洗脱流速(图7)。

图6 洗脱剂体积对多糖解吸的影响

注：数值为平均值±标准偏差(n=3)，图中的字母表示在0.05水平上差异显著。

3 结论与讨论

高效、安全地提取植物中天然生物活性物质是一项具有挑战性的任务。目前，已经开发出多种提纯方法来提纯天然活性物质，如超临界流体萃取法[17]、高速逆流色谱法、双水相萃取法、高效液相色谱法等，然而这些方法在应用中存在对环境造成污染、操作过程复杂、人工成本高、不适合工业化大量生产等缺点。因此，寻找一种操作简单、高效率、低成本的纯化方法极为重要。大孔吸附树脂是一种高分子合成材料，具有良好的吸附性质和解脱性，同时可以重复利用，可以高效、简单、环保、节能地纯化植物中的天然活性物质[18]。目前已经被广泛的应用在天然活性物质的纯化和分离，如黄酮、多酚和多糖类化合物的纯化。研究发现，AB- 8型树脂对植物多糖具有良好的吸附和解析作用，可以用来纯化植物多糖。张涛涛[19]在大孔树脂纯化杜仲多糖工艺研究中发现，当上样浓度为0.6 mg/mL，以1.0 mL/min流速上样至AB-8型大孔树脂吸附后，用150 mL的65%乙醇溶液，以1.0 mL/min流速洗脱时，树脂对多糖的吸附率和解吸率分别为90.6%和90.2%，最终多糖含量可达到35.8%。孙伟等[20]用大孔树脂纯化桑白皮多糖的工艺研究中发现，D-101 型大孔吸附树脂分离纯化桑白皮多糖的最佳上样条件为：pH值3.0，上样速度为2.0 BV/h，上样浓度为4.0 mg/h。而最佳洗脱条件为75%的乙醇洗脱剂用量为3.5 BV、流速为1.0 BV/h，经过该工艺纯化后，秦白皮多糖的纯度达到74.55%。邱晓[21]在党参多糖的提取纯化工艺及应用研究中发现，党参多糖分离纯化工艺的上样浓度10 mg/mL、上样体积160 mL、柱径高比1∶8、洗脱液为5%乙醇溶液，所得固体产物中党参多糖的含量为25.12%。同样，该试验也得出AB-8为纯化狼爪瓦松愈伤组织中多糖的最优树脂，但进料浓度、流速、体积以及洗脱剂浓度、流速、体积与其它研究有差异，这可能与不同植物所含多糖种类不同相关。该研究中，大孔吸附树脂对狼爪瓦松愈伤组织多糖纯化的最佳条件是进样浓度为1.5 mg/mL，进样体积为2 BV，进样流速为1 BV/h，洗脱剂浓度为65%，洗脱剂体积为2.5 BV，洗脱流速为2 BV/h。可以得出用大孔吸附树脂对狼爪瓦松愈伤组织多糖进行纯化具有可行性。该结果为今后狼爪瓦松愈伤组织多糖纯化提供了实验依据，也为狼爪瓦松资源的有效开发利用提供新途径，且大孔树脂的成本低廉、操作简单、效率高，可为今后大规模生产提供科学参考。