核酸适配体结合纳米材料的生物传感器在黄曲霉毒素检测中的应用

牛梦雨， 李铉军， 郭志军

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

近年来，真菌毒素对食品安全的污染日趋恶化，其中，有关黄曲霉毒素(Aflatoxin,AF)引起对农产品、乳制品、肉制品等食品的污染事件屡见不鲜，对食品安全和人类健康造成严重的威胁，给社会经济造成巨大的损失。黄曲霉毒素是一种典型的真菌毒素，主要是由黄曲霉和寄生曲霉代谢产生的化学结构类似的二呋喃香豆素衍生化合物[1-2]。1993年，世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构(IARC)将黄曲霉毒素划定为Ⅰ类致癌物，经黄曲霉毒素感染的人或动物会使肝脏组织遭到破坏，严重时则可导致肝癌甚至死亡，具有致命性危害[3]。根据黄曲霉毒素的化学结构和毒性差异，主要可分为B1、G1、G2、M1、M25种[4]。黄曲霉毒素分布广泛，在花生、玉米、大米、大豆等农作物及其制品中主要以 B1、G1、G2为主，乳及其制品中主要是以M1、M2为主[5]。其中毒性最强是AFB1，其毒性相当于氰化钾的10倍，砒霜的68倍，三聚氰胺的416倍，具有相当强的致畸、致癌、致突变作用[6]。目前，国内外针对 AF的检测方法主要包括酶联免疫法[7]、气相色谱法[8]、高效液相色谱法[9]、薄层色谱法[10]、胶体金免疫层析技术[11]等，以上这些方法的应用由于受到检测过程繁琐、检测仪器设备昂贵、且需要专门的操作人员等原因，在一定程度上限制了AF在实际检测中的应用。因此，建立高效便捷、成本低廉、适应性强的AF检测方法，在分析食品安全检测技术领域尤为重要。自上个世纪80年代以来，生物传感器由于灵敏度高、检测限低等优良性能在检测领域发展迅速，其中具有代表性的核酸适配体生物传感器在真菌毒素检测领域中发挥了重要作用，纳米材料因具有较好的结构性能在生物传感器领域得到广泛应用，从而改善生物传感器检测的灵敏度。该文对近几年来核酸适配体结合纳米材料构建的比色、荧光、电化学、拉曼4种生物传感器在黄曲霉毒素检测中的应用研究进行综述。

1 核酸适配体

核酸适配体(Aptamer)，简称适配体，是指经过一种新的体外筛选技术—指数富集配体系统进化(SELEX)，在随机单链寡聚核苷酸文库中获得的能特异结合蛋白或其他小分子物质的单链寡聚核苷酸，可以是RNA也可以是DNA，长度一般为25～60个核苷酸[12-13]。适配体能通过芳香环、π-π堆积、范德华力和带电基团之间的静电相互作用形成特殊的三维结构，与靶分子特异性结合[14]。适配体具有亲和力高、特异性强、成本低、性质稳定、靶分子范围广、易化学合成、改造与标记等优点，目前研究常被用作分子识别元件[15]。由于适配体是一段单链寡聚核苷酸，本身不具备识别能力，在适配体与靶分子物质特异性结合过程中无法产生可检测的物理化学信号，因此，需要将适配体经筛选修饰或借助换能器，将核酸适配体的识别过程转变为易于识别检测、可定量处理的信号[16]。

2 核酸适配体生物传感器

生物传感器(Biosensor)主要由生物识别单元(抗体，适体)、换能器(电极、光波导、悬臂)、信号转换器和信号处理器4部分组成[17]。核酸适配体生物传感器(Aptamer-based biosensors)是由适配体为生物识别原件，经过筛选修饰与目标分析物产生特异性结合引起检测信号变化，从而实现对目标分析物的检测[18]。目前根据检测信号的不同，可将核酸适配体生物传感器主要分为比色适配体生物传感器、荧光适配体生物传感器和电化学适配体生物传感器、拉曼信号(SERS)适配体生物传感器、离子共振(SPR)适配体生物传感器、电化学发光(ECL)免疫传感器等[19-20]。近年来，核酸适配体生物传感器已广泛应用于有机农药残留[21]、重金属检测[22]、生物毒素等[23]领域之中。

3 纳米材料的应用现状

纳米级结构的材料简称为纳米材料(nanomaterials)，是指在1～100 nm尺度范围内，纳米材料的尺度与性能可同时发生特异性变化。纳米材料具有优于其他材料的光学性质、催化性质及特殊的物理机械性质等，在光学、电学、热学、磁学、催化、传感等领域都有广泛的应用[24]。纳米材料因其良好的生物兼容性、稳定性、表面等离子共振等特性在适配体生物传感器领域中具有标记或增强信号的作用，从而提高检测结果的灵敏度[25]。如纳米金、碳纳米材料、磁性粒子、半导体量子点(QDs)、二氧化硅纳米颗粒和杂化纳米结构都是生物传感器领域常用的纳米材料。其中，球形AuNPs由于其独特的物理化学性质，如制备和改性简单、相容性好、优异的光学性能和独特的催化活性，在生物分析领域引起了特别的关注。良好的磁学性能的Fe3O4成本低且易于制备，是最为常用的磁性纳米材料，除此之外，基于量子点等其他纳米材料在构建适配体生物传感器方面发挥了重要作用[26]。现如今，纳米材料越来越多地应用于灵敏度高、选择性强、快速和经济有效的分析设备，如纳米颗粒，纳米管，纳米线等已经被创建用于生命科学和生物技术等新型分析领域之中[27]。

4 结合纳米材料的适配体生物传感器在黄曲霉毒素检测中的研究进展

4.1 比色适配体生物传感器

比色信号检测技术是指利用通过对溶液的颜色深度的比较，从而确定待测组分的含量的一种检测方法[28]。由于操作简单、灵敏快速、用肉眼观察就可以检测等优点，是检测平台最为常用的检测方法之一。

Luan等[29]开发了一种无标记的比色信号适配体传感器，利用未修饰的纳米金(AuNPs)和AFB1适体发生可视性变化，检测AFB1。当AFB1不存在时，基于单链DNA带有正电荷的碱基与带有负电荷的纳米金表面产生静电排斥作用，使适体吸附到AuNPs表面，在高浓度NaCl的诱导下，AuNPs仍保持稳定。当加入AFB1后，形成了AFB1/适配体复合物并从AuNPs的表面释放，导致AuNPs溶液在高浓度NaCl的作用下破坏其稳定性，发生聚集。肉眼可以看出这一过程中溶液由酒红色变为蓝紫色。通过UV-vis光谱仪测定得到线性响应和确定该系统的检测灵敏度分别为0.025～100 ng/mL和0.025 ng/mL。

杨子音[30]选择纳米银(AgNPs)及其复合粒子(SiO2-AgNPs)2种体系，并结合核酸适配体对AFB1进行可视化检测。其原理为AgNPs在高浓度NaCl的诱导下易发生团聚现象，溶液会发生颜色变化。在AFB1不存在的情况下，适配体由于静电作用吸附到AgNPs表面，AgNPs保持稳定无团聚现象，溶液颜色为黄色。AFB1存在时，由于适配体与AFB1特异性结合并脱离AgNPs表面，AgNPs在NaCl的诱导下发生聚集，溶液颜色变为棕红色。纳米银(AgNPs)及其复合粒子(SiO2-AgNPs)2种体系所得到的检测限分别为11.761和10.984 ng/L。

4.2 荧光适配体生物传感器

基于荧光的适体传感器主要分为无标记和带标记2类。无标记适体传感器不需要任何类型的生色团或荧光团，带标记得适配体传感器则至少需要一种形式的发色团或荧光团。常见的标记材料如：金纳米粒子(AuNPs)、量子点(QDs)、氧化石墨烯(GO)等广泛应用于适配体传感器的构建[31]。

wei等[32]以金纳米球(AuNSs)作为荧光猝灭材料，建立出一种简单、灵敏的AFB1检测方法。其以羧基荧光素(FAM)标记的具有发夹结构(HP)的AFB1适配体互补链作为信号探针，根据适配体互补链发夹结构的开放性和封闭性，可用于构建荧光传感器。检测原理为：当FAM标记的HP与AFB1适配体杂交，发夹结构打开，形成双链DNA，当双链DNA在被Bio-SA修饰的AuNSs表面与其特异性结合时，FAM远离AuNSs，导致猝灭效率降低，荧光强度增强。当AFB1存在时，AFB1优先与适配体结合，双链DNA裂解，标记FAM的HP恢复发夹结构，使FAM接近AuNSs，发生荧光猝灭，荧光强度降低。荧光强度的变化用于检测AFB1的添加量，在0.1～10 ng/mL的检测范围内得到最低检测0.021 3 ng/mL，并将已知浓度的AFB1加入玉米样品中得到92%～112%的回收率。

Hongxia Tan等[33]基于介孔二氧化硅纳米粒子(MSN)，设计一种新颖、简单且无标签的适体生物传感器用于检测AFB1。选择MSN-NH2作为控制释放系统的载体，将荧光指示剂(Rh6G)作为释放信号探针加载到粒子内部。作为“门控分子”和分子识别探针且带负电荷适配体与带正电荷的MSN-NH2相互作用，将适配体固定在MSN-NH2粒子表面。适体传感器(适体修饰的MSN-NH2装有Rh6G的抗体)以检测目标AFB1。在AFB1存在下，适配体与AFB1之间的特异性结合，适配体可以从MSN-NH2中脱附，从而打开“门”，释放信号探针(Rh6G)。AFB1的浓度和AFB1的定量检测最终可以通过荧光强度的改变来实现。测定结果表明，当AFB1浓度为0.5～50 ng/mL时，荧光强度线性增加，检测限低至0.13 ng/mL。

郭婷等[34]通过荧光共振能量转移原理，利用磁性纳米材料的荧光猝灭能力和磁性分离技术，构建了基于磁性纳米材料(Fe3O4)的荧光适配体生物传感器，用于检测牛奶中AFM1。当体系中AFM1不存在时，在静电作用下，标记羧基荧光素(FAM)的适配体吸附在Fe3O4磁性纳米颗粒表面，通过能量共振转移导致荧光猝灭；当体系中存在AFM1时，适配体与AFM1特异性结合并形成折叠结构，适配体从Fe3O4磁性纳米颗粒表面脱附，使荧光信号恢复，从而实现对FAM1的定量检测。在0.05～0.70 μg/L线性范围内，检测限为0.02 μg/L。检测牛奶中AFM1的回收率为82.5%～102.3%。

Lu Z等[35]利用由CdTe/GO/QDs组成的猝灭体系，通过将AFB1的特定硫醇化适体连接到量子点(QDs)表面上，形成QDs-适配体复合结构，GO纳米片通过π-π共轭吸附QDs-适配体，导致QDs荧光信号猝灭。加入AFB1后，AFB1与QDs-适配体特异性结合，占据π-堆积相互作用的空间，使QDs的荧光得以恢复，根据QDs的荧光回收率反映AFB1的浓度。该方法得到的检测限为0.312 ng/mL。

4.3 电化学适配体生物传感器

电化学适配体传感器是将适体分子识别和电化学信号相结合，把生物识别信号转化为电信号，通过监控电流、点位或电阻的变化来检测目标分子。

王春燕等[36]利用“信号关闭”原理设计了一种电化学适配体生物传感器，实现了对AFB1的检测。其利用对苯二甲酸铜(Cu-TPA)中Cu(Ⅱ)可以产生强的电化学信号，并通过将金纳米颗粒(AuNPs)负载到Cu-TPA上形成Cu-TPA/AuNPs复合结构，进一步与DNA1(S1) 结合形成Cu-TPA/AuNPs/S1信号探针，再将Cu-TPA/AuNPs/S1分散液滴加到S3/S2/GE电极表面，形成Cu-TPA/AuNPs/S1/S3/S2/GE电化学传感器，来进行电化学检测。当加入一定量的AFB1后，使AFB1和S3相互作用，Cu-TPA/AuNPs/S1信号探针从电极表面脱落，差分脉冲伏安(DPV)信号降低，随着AFB1浓度的增加，在10-5～10 ng/mL范围内氧化峰电流(I)与AFB1浓度的对数(lgc) 呈反比，测得的检测限为4.2×10-6ng/mL(S/N=3)，且具有良好的重现性，利用该核酸适配体生物传感器检测啤酒中的AFB1得到95%～106%的回收率。

Sondes Ben Aissa等[37]基于二茂铁和硅纳米粒子(SiNPs)的设计了一种新型适配体传感器用于检测牛奶中的AFM1。鉴于硅纳米材料可增加电容功率的半导电特性，并通过电化学阻抗谱法(EIS)测量表面束缚二茂铁膜的氧化还原电容信号的变化，开发了一种基于电化学电容谱(ECS)的新型电容转导系统。首先，采用聚对苯二胺(PpPD)/硅纳米复合材料对碳表面进行功能化，放大背景电容信号。然后二茂铁二酸(作为碳表面与适配体连接剂)通过碳二亚胺交联反应与胺端配体共价结合，第2个游离羧基通过酰胺化固定AFM1适配体。当AFM1存在时，适配体与AFM1共价偶联后形成G-四链体折叠结构，通过在生物识别层中适配体负电荷的重新分配，此时，形成的适配体/AFM1复合物改变了带正电荷的二茂铁作为氧化还原探针的状态密度，从而导致氧化还原电容值的降低，ECS信号下降。测得最低检测限为1.48 pg/L。

4.4拉曼信号(SERS)适配体生物传感器

利用拉曼检测信号的适配体生物传感器具有灵敏性高，特异性强、检测快速高效等优点。蒲洪杉等[38]采用SH-cDNA修饰的Fe3O4@Au纳米花(Fe3O4@AuNFs)作为捕获探针，将SH-Apt修饰的Au@Ag纳米球(Au-4MBA@AgNSs)作为信号探针建立了一种新型SERS适配体传感器检测AFB1。AFB1适体及其互补链的识别桥接了捕获探针和信号探针之间的联系，然后产生了4-巯基苯甲酸(4-MBA)的强SERS信号。随着适配体与AFB1的优先结合，信号探针从捕获探针中释放，从而导致SERS强度线性降低。根据SERS强度的改变，检测AFB1的浓度，在0.000 1～100 ng/mL的线性范围内，测得的检测限为0.40 pg/mL。此外，在花生油样品中获得96.6%～115%的回收率。

Quansheng Chen等[39]基于氨基酸末端适配体共轭磁珠(CS-Fe3O4)、AuNR@DNTB@Ag纳米棒(ADANRs)及氨基末端的AFB1适配体(NH2-DNA1)，设计了一种新型的拉曼信号适配体生物传感器技术，提高了AFB1检测的灵敏度和稳定性。其主要分别用NH2-DNA1-CS-Fe3O4和SH-DNA2-ADANRs作为富集纳米探针和报告纳米探针，将(二硫代二硝基苯甲酸)DNTB嵌入金、银核/壳纳米棒中，因其具有较大的拉曼散射截面且无荧光干扰，从而提高了拉曼信号的稳定性。当AFB1不存在时，CS-Fe3O4与ADANRs及适配体形成复合物，保持拉曼信号的稳定性，当AFB1存在时，由于AFB1与NH2-DNA1-CS-Fe3O4竞争性结合，诱导SH-DNA2-ADANRs与CS-Fe3O4解离，拉曼信号强度降低，根据拉曼信号的强度变化检测AFB1的浓度，在0.01～100 ng/mL线性范围内，检测限为0.003 6 ng/mL，相关系数为0.986。

Xiuming Yang等[40]利用纳米晶体(GDADNTs)作为传导纳米探针，氨基酸末端适配体缀合磁珠(CS-Fe3O4)作为捕获纳米探针，开发了一种具有较高活性和稳定性的拉曼信号适配体生物传感器AFB1检测平台。在检测过程中，传导纳米探针、捕获纳米探针与适配体结合，分别形成传导纳米粒子(GDADNTs-Apt)与捕获纳米粒子(CS-Fe3O4-Apt)复合结构，当AFB1不存在时，GDADNTs-Apt与CS-Fe3O4-Apt不会产生聚集现象，经磁分离后无拉曼信号产生，当AFB1存在时，GDADNTs-Apt、CS-Fe3O4-Apt与AFB1会通过适配体特异性结合聚集在一起，形成(GDADNTs-Apt-AFB1-Apt-CS-Fe3O4)检测平台，经磁分离后析出物中有拉曼信号产生，根据不同浓度AFB1中SERS强度的不同，达到高灵敏度定量检测的目的，在0.001～10 ng/mL线性范围内，其检测限为0.54 pg/mL。

对于黄曲霉毒素的检测，以上4种基于纳米材料的适配体生物传感器的相关报道较多，除此之外，还有表面等离子共振(SPR)适配体生物传感器、电化学发光(ECL)免疫传感器等，但这几种生物传感器开发难度大、稳定性差且成本较高，所以基于纳米材料的其他适配体生物传感器在黄曲霉毒素检测方面还有待于进一步研究。

5 展望

黄曲霉毒素由于其强烈的毒性与致癌性，严重影响食品质量安全并且威胁着人们的身体健康，建立高效简便的测定方法十分必要。适配体具有高灵敏度、高选择性、低成本等优点，促使适配体生物传感器在分析研究领域备受青睐。纳米材料的迅速发展，现已在医疗、农业、食品等方面得到普遍应用，也为基于纳米材料的适配体生物传感器创造了更为广阔的发展空间。随着目前检测技术的不断发展，生物传感器的性能也在不断完善，相信基于纳米材料的适配体生物传感器在未来食品安全领域其他有害物质检测方面也将拥有更为广阔的开发前景。