槐果碱联合奥沙利铂对裸鼠结肠癌肝转移抑制作用的实验研究*

张晓微，杨宇慎，赵雪峰

大连大学附属新华医院普外科 (大连 116021)

结直肠癌肝转移是结直肠癌患者死亡的主要原因，一半以上患者在疾病不同阶段发生肝转移[1]。对结直肠癌肝转移的治疗，外科切除作用有限，仅20%的患者能从手术中获益[2]。近年来，以奥沙利铂为基础的辅助化疗极大地弥补了外科手术的不足，但由于这些化疗药物长期或大量应用会造成耐药，故而在结直肠癌肝转移治疗中的价值并不明显。因此，研发一种新的、可以解决这一困境的治疗方案对于结直肠癌肝转移患者将具有十分重要的临床意义。槐果碱是一种四环噻嗪啶类生物碱，主要来自中草药豆科苦豆草。槐果碱不仅具有免疫调节、抗炎、止疼及心脏保护等药理作用，还可抑制多种恶性肿瘤细胞增殖[3-6]。近期，Zhang等[7]证实槐果碱可抑制肝细胞癌的增殖；Liu等[8]指出槐果碱可通过miR-21来抑制头颈部癌进展和逆转上皮间质化过程；Wang等[9]进一步研究报道，槐果碱可下调MEK/ERK/VEGF通路而抑制结直肠癌的发生和远处转移。因此，槐果碱和奥沙利铂的联合应用或可为上述问题的解决提供一个新的思路。本研究通过构建裸鼠结肠癌肝转移模型来初步探讨槐果碱与奥沙利铂联合治疗对结肠癌肝转移的抑制效果。

材料和方法

1 实验材料 槐果碱购自普思生物科技有限公司，与二甲亚砜配制成0.1 mol/L储存液备用；奥沙利铂购自江苏恒瑞股份有限公司；LoVo人结肠癌细胞株由大连大学附属新华医院中心实验室传代捐助；BALb/c品系裸鼠40只，6周龄雌性，体重18～20 g，由大连医科大学实验动物研究中心购买。

2 实验方法

2.1 细胞培养：LoVo人结肠癌细胞株接种于100π培养皿中，并在37℃、5%CO2，含10%牛血清的RPMI 1640培养液中传代培养，每2～3 d换1次培养液。培养至80%～90%融合后，利用0.25%胰酶消化液消化，1200 r/min离心3 min，丢弃上清液，加无血清RPMI 1640培养液洗细胞2次，显微镜下计数。制备成细胞浓度为5×107/ml的混悬液，待动物模型中备用。

2.2 动物模型设计：制模前1周为稳定期，减少一切刺激；1周后，利用 LoVo人结肠癌细胞株建立稳定型裸鼠肝转移模型40只[10]；按尾静脉注入成分不同，随机分成10只槐果碱单一应用组[3.57 mg/(kg·d),SC组]、10只奥沙利铂单一应用组[1000 μg/(kg·d),Oxa组]、10只槐果碱联合奥沙利铂组(SC 3.57 mg/(kg·d)联合Oxa 1000 μg/(kg·d),SC+Oxa组)及10只对照组(RPMI 1640 50μl,Control组)；分组制模4周后处死，并观察各组情况。

2.3 观察指标：每天常规观察记录裸鼠状态，结肠癌肝转移模型分组制模(药物干预模型) 4周后各组裸鼠进行脱颈处死。首先解剖观察肝质量、血性腹水、胆汁瘀积及肝转移评分，其次观察局部浸润发病率、淋巴结转移率及腹膜种植转移率，同时观察胸腔内、颅内有无转移情况。所有肉眼可疑部位照相并取材行病理学检查。

2.4 组织病理学检测：四组肝转移瘤组织、淋巴结转移瘤组织及腹膜种植瘤组织标本进行病理学检测分析，将组织标本横行切开，蜡块包埋后按4 μm厚度切片，进行HE染色。

结 果

1 各组模型肝转移瘤的形态及病理学差异 各组裸鼠结肠癌肝转移模型成功率为100%(40/40)。在Control 组，肝转移瘤遍布于肝缘，呈融合生长，聚集成团。而在其他三组，肝转移瘤散在分布，数量较少，且SC+Oxa组甚至出现坏死病灶。见图1。

2 各组模型肝转移瘤的形态及病理学表现 与Control组相比，SC组、Oxa组及SC+Oxa组均可显著降低肝转移评分，其中SC+Oxa组更能显著抑制肝转移形成，差异有统计学意义(P<0.05)。与Control组相比，SC组、Oxa组及SC+Oxa组可显著降低肝质量、减少胆汁瘀积、血性腹水及淋结转移的发生率，差异有统计学意义(P<0.05)。Control组局部浸润发生率和腹膜种植转移率有增高趋势，但其差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 四组裸鼠结肠癌肝转移模型观察指标比较

讨 论

目前，以奥沙利铂为基础的辅助化疗方案是结直肠癌肝转移的标准治疗方案。奥沙利铂主要通过和DNA结合形成铂-DNA加合物而阻断DNA复制，导致细胞周期停滞和死亡。虽然奥沙利铂可有效改善结

肠癌转移患者的总体生存时间，但长期应用会因耐药而致使治疗失败[11]。近年来，许多研究主要致力于减弱奥沙利铂的毒性作用，而在改善奥沙利铂耐药、增强奥沙利铂抗肿瘤效果方面却较少涉及[12-13]。

注：A～D：Control 组;E～H：SC组;I～L：Oxa组;M～P：SC+Oxa组

中草药在我国经历数千年的发展，早已形成一套独特的理论体系。现已证实，许多中草药具有抗肿瘤作用，且已成为结直肠癌和其他多种恶性肿瘤的综合治疗措施之一[14]。与传统的抗癌药物不同，中草药具有以下几大优势：①传统抗癌药物的细胞毒性效果往往是非特异性的，在杀伤肿瘤细胞的同时，会对机体正常细胞造成极大的毒副作用。而具有抗肿瘤效果的中草药则可在不影响正常细胞基础上选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，故而毒副作用小；②肿瘤转化和进展是一个多阶段、多步骤的过程，往往涉及多个信号通路。因此，大多数传统抗癌药物常常因只作用于一个信号通路中的单个信号分子而导致治疗失败。而具有抗肿瘤效果的中草药则可通过靶定多个信号通路来杀伤肿瘤细胞。③近期，许多学者发现中草药还具有增强传统抗癌药物敏感性的药理作用。如有研究报道冬凌草甲素可激活JNK、P38和ERK信号通路来增强癌细胞对5-FU的敏感性[15]。Gupta等[16]指出白藜芦醇通过调节凋亡通路、下调药物转运蛋白和肿瘤细胞增殖相关蛋白以及抑制NF-κB和STAT3信号通路来克服化疗药物耐药。因此，具有抗肿瘤效果的中草药在恶性肿瘤治疗方面潜力巨大。

槐果碱是一种四环噻嗪啶类生物碱，主要来自中草药豆科苦豆草。近期研究证实，槐果碱不仅可通过阻断AKT/GSK-3β/β-catenin轴而抑制肝细胞癌增殖，还可通过miR-21来抑制头颈部癌进展和逆转上皮间质化过程，槐果碱亦可下调MEK/ERK/VEGF通路而抑制结直肠癌的发生和远处转移[7-9]。这些发现表明槐果碱可通过调节多个信号通路来发挥抗癌效果。然而，目前很少有学者关注槐果碱与传统化疗药物奥沙利铂联合应用对结肠直癌肝转移的转移抑制效果。本研究通过构建裸鼠结肠癌肝转移模型，发现单独应用槐果碱或奥沙利铂均可抑制结直肠癌肝转移灶的形成，而两者联合应用可显著增强转移抑制效果，明显降低肝转移评分。该结果表明槐果碱不仅可抑制结直肠癌肝转移，亦能增强癌细胞对奥沙利铂的敏感性，改善癌细胞对奥沙利铂的耐药性。

值得一提的是，对于槐果碱抑制结直肠癌肝转移及改善奥沙利铂耐药的分子机制仍不十分清楚，但许多研究表明上皮间质化与其密切相关。Shen等[17]证实结直肠癌上皮间质化会增强肿瘤侵袭和远处转移能力。Guo等[18]指出转录因子ZEB1高表达可通过诱导上皮间质化而促使结直肠癌细胞对奥沙利铂耐药。因此，上皮间质化在诱导肿瘤远处转移的同时，还促使奥沙利铂耐药的发生。另一方面，Wang等[9]报道槐果碱能下调MEK/ERK/VEGF通路而抑制结直肠癌远处转移。Shen等[19]进一步证实ERK的抑制可阻断结直肠癌上皮间质化过程。这些研究提示槐果碱或可通过下调ERK而逆转上皮间质化过程，从而在抑制结直肠癌肝转移的同时，改善奥沙利铂耐药。很显然，SC/MEK/ERK/VEGF/EMT信号通路的揭示将有助于我们更深入的理解槐果碱的作用机制。因此，本团队将以此为基础，继续开展后续实验以明确槐果碱、MEK/ERK/VEGF通路及上皮间质化过程之间的关系,从而阐明槐果碱抗结直肠癌肝转移的分子机制。

综上所述，本研究阐述了槐果碱及其联合应用对裸鼠结肠癌肝转移模型的抑制效果。槐果碱与奥沙利铂联合药物干预可加大转移抑制效果，但非常有必要进一步临床试验的量化指标来判定转移抑制的临床疗效。