两种前处理方法联合使用定性、定量测定豆芽中4-氯苯氧乙酸

□ 尤晓惠 郑晓敏 谢 甜 刘张霞 重庆市涪陵食品药品检验所

4—氯苯氧乙酸是一种植物生长调节剂，在豆芽生产中，4—氯苯氧乙酸可以促进豆芽下胚轴粗大，减少根部萌发，加速细胞分裂[1]，使豆芽更加肥嫩、粗壮，提高豆芽的产量。曾经很长一段时间4—氯苯氧乙酸被广泛用于豆芽的生产中。我国相关部门发布的2015 年第11 号公告，明令禁止4—氯苯氧乙酸用于豆芽生产。然而4—氯苯氧乙酸依然被滥用于豆芽的生产中，每年国家相关部门发布的不合格食品通告中非法使用4—氯苯氧乙酸导致的豆芽不合格情况频频出现。

目前，豆芽中4—氯苯氧乙酸的测定标准有《豆芽中植物生长调节剂的测定BJS 201703》和《SN/T 3725—2013 出口食品中对氯苯氧乙酸残留量的测定》。BJS 201703 标准采用QuChERS 方法对豆芽样品进行前处理，方法简便、快速，但是处理后的样品溶液杂质非常多，液质测定时基质效应非常严重，造成豆芽中4—氯苯氧乙酸定量测定结果不够准确。SN/T 3725 标准中，通过调节豆芽样品溶液的pH 值，改变4—氯苯氧乙酸在溶液中的溶解性对豆芽样品中的4—氯苯氧乙酸进行提取，提取后的样品溶液经处理后再通过MAX 小柱进行净化，液质测定时几乎没有基质效应，但是该方法的提取阶段非常繁琐并且需要消耗大量的有机试剂，净化阶段也非常的耗时。文献中也主要是采用直接提取法、QuChERS 方法和固相小柱净化法进行前处理[2—10]，本文拟建立两种前处理方法，一种方法可以对豆芽中4—氯苯氧乙酸进行快速筛查；另一种方法可以最大程度地消除基质干扰，从而对4—氯苯氧乙酸进行准确定量。

1 材料和方法

1.1 仪器

Agilent1290 高效液相色谱仪（Agilent 公 司）和AB4500Qtrap 质谱 仪（ABSCIEX 公 司），Milli—Q 超 纯水仪（Merck—Millipore 公司），氮吹仪；Waters Oasis MAX 固相萃取小柱（20 mg/mL）。

1.2 试药试剂

4—氯 苯氧乙酸钠（Standford Chmi—cals），乙腈、甲醇为色谱纯（美国Fisher 公司），氨水（川东化工），甲酸（阿拉丁），净化管（含150 mg PSA、900 mg MgSO4、150 mg C18）（岛津）。

1.3 色谱和质谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸水（A）—0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脱（梯度洗脱程序：0 ～3.0 min，90%～10%A；3.0 ～3.5 min，10% A；3.5 ～4.0 min，10% ～90%A；4.0 ～6.0 min， 90%A）；流速：0.2 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：2 μL。

离子化模式：电喷雾电离负离子模式（ESI—）；扫描方式：多反应监测（MRM）。

监测离子对：185.0/126.9（定量离子对）、185.0/90.9、185.0/129.0。

1.4 方法

1.4.1 QuChERS 方法

称取粉碎均匀的豆芽样品5.000 g置于50 mL 离心管中，精密加入10 mL 含1%甲酸的乙腈溶液，涡旋混匀5 min，5 000 r/min 离心5 min。吸取上述上清液8 mL 至净化管，立即快速涡旋混合2 min，5 000 r/min离心5 min。精密吸取上层有机相5 mL 至氮吹管，45 ℃氮吹至近干，用1.00 mL 20%乙腈水溶液涡旋复溶，过0.22 μm 滤膜，上机。

1.4.2 QuChERS/MAX 方法

称取粉碎均匀的豆芽样品5.000 g置于50 mL 离心管中，其余操作同“QuChERS 方法”，氮吹至近干，用3 mL 2%甲酸水溶液涡旋复溶。

MAX 固相萃取小柱预先用3 mL甲醇和3 mL 水活化。将上述样品溶液加入小柱中，自然流干后，依次用3 mL 5%氨水、3 mL 30%甲醇的水溶液（含2%甲酸）、3 mL 甲醇淋洗，最后用3 mL 含8%甲酸的甲醇溶液洗脱。收集洗脱液于氮吹管中，45 ℃氮吹至近干，用1.00 mL 20%乙腈水溶液涡旋复溶，过0.22 μm 滤膜，上机。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法

QuChERS 方法用1% 甲 酸— 乙腈进行提取，由于乙腈对大部分化合物均有一定的溶解能力，可有效地将4—氯苯氧乙酸从豆芽中提取出来。然后通过加入无水硫酸镁使水相和有机相分层，降低4—氯苯氧乙酸在水相中的溶解度，从而将其转移至乙腈层中。另外加入的PSA 和C18，可去除部分色素、有机酸、酚类及非极性干扰物，从而在提高回收率的同时减少干扰。QuChERS 前处理得到的样品溶液非常浑浊，即样品溶液中还含有大量的干扰物质。

为了进一步降低干扰，通过MAX小柱对样品溶液进行进一步净化，以去除干扰杂质。通过对4—氯苯氧乙酸结构的分析，样品溶液可以通过反向固相萃取小柱进行净化，又可以用阳离子交换小柱进行净化，因此，选择MAX 小柱作为净化柱。样品溶液过柱后，分别选择了3 种溶液体系对小柱进行淋洗，依次用3 mL 5%氨水、3 mL 30% 甲醇的水溶液（含2% 甲酸）、3 mL 甲醇淋洗，通过调节溶液的pH 值及逐步提高洗脱液的洗脱能力，使样品中的干扰物得到最大程度的去除。

2.2 基质效应

对5 个空白绿豆芽样品和5 个空白黄豆芽样品分别用2 种前处理方法进行处理，得到空白样品溶液。将10 μg/mL 的标准溶液（溶剂为甲醇）分别用空白样品溶液及20%乙腈水溶液配置成100 ng/mL 的溶液，用于考察不同样品溶液的基质效应（X），基质抑制效应的计算公式见式（1）。

式（1）中：A 为峰面积。

通过考察，QuChERS 方法基质抑制效应在55%～78%，不同豆芽的基质效应不同且黄豆芽比绿豆芽的基质抑制作用更强，净化效果较差。定量检测时虽然可以通过空白基质标曲进行基质效应的消除，但是由于不同豆芽间基质效应不同，空白基质标曲并不能很好地消除基质效应，因此，定量检测时会出现定量测定结果不够准确的问题。

QuChERS/MAX 方法， 基质抑制均小于5%，净化效果非常好。因此，再通过空白基质标曲对定量结果进行校正，可以取得比较准确的定量结果。

2.3 回收率

在样品中分别加入10、20、100 μg/kg的标准溶液，按照两种处理方法进行处理。同时做阴性样品，得到空白基质溶液，同时测定，并计算加标回收率。

通过考察，QuChERS 方法各添加水平的回收率在79% ～90%。QuChERS/MAX 方法各添加水平的回收率在75%～91%。

通过对回收率的考察，可知QuChERS 方法可以将豆芽中的4—氯苯氧乙酸有效提取出来。而QuChERS/MAX 方法，样品溶液经过MAX 的进一步净化在净化过程中4—氯苯氧乙酸并没有损失。两种方法的回收率均较高，可满足检测要求。

3 结论

两种前处理方法的回收率均较高，均可满足实验要求。QuChERS 方法前处理后具有严重的基质抑制效应，并且不同样品之间的基质效应差别较大。但是QuChERS方法更加的快速、便捷。QuChERS/MAX 方法，经过多环节的净化，基质效应非常小，但是由于QuChERS 方法前处理后的样品溶液杂质依然非常多，在MAX 小柱净化阶段，一方面过柱的速度非常的慢，另一方面净化环节较多，使得前处理耗时长，不适合大批量样品的快速筛查。因此，QuChERS 方法适合样品中4—氯苯氧乙酸的快速筛查；QuChERS/MAX 方法适合样品中4—氯苯氧乙酸的定量检测。