鸡蛋中氟苯尼考残留检测的改进方法

杜杨，杜磊

（1.河南省安阳市畜产品质量安全监测检验中心，河南安阳 455000；2.安阳工学院生物与食品工程学院，河南安阳 455000）

氟苯尼考属于氯霉素类（CAPs）［1］，包括氯霉素（CAP）及其衍生物，又称酰胺醇类。氟苯尼考为动物专用的半合成酰胺醇类抗生素，其特点是抗菌谱广、体内分布广泛、注射或内服均吸收良好［2］。氟苯尼考（FF）具有较强的免疫抑制作用［3］，并具有胚胎毒性［4］。随着FF 在兽医临床的大量使用，其耐药菌株也在不断增加。

动物源性食品中CAPs 及其代谢产物的残留检测方法主要包括高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、液相色谱-质谱法（LC-MS）、酶联免疫法（ELISA），其中确证方法主要是质谱法［5］。本试验参照《GB/T 22338-2008 动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》，提出相应改进措施，在确保检测结果准确与可靠的前提下，简化前处理过程，缩短前处理时间，对提高鸡蛋中氟苯尼考残留检测的工作效率具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试剂与耗材 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682 规定的一级水。甲醇：色谱纯，乙腈：色谱纯，氨水，正己烷，乙酸乙酯，氟苯尼考标准品：纯度≥99.0%；微孔滤头（尼龙）：孔径0.22 μm。

1.2 仪器设备 天平：感量0.01 g、0.000 01 g，高速冷冻离心机：≥8 000 r/min，液相色谱-串联质谱仪：带电喷雾离子源，移液器：100 μL、1 000 μL，氮吹仪，均质器，多管涡旋振荡器。

1.3 仪器条件 色谱柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18（1.7 μm，2.1×100 mm）；柱温：30 ℃；进样量：2.00 μL；流动相：A乙腈，B水。

1.4 检测方法

1.4.1 标准储备液、中间液及工作液配制 标准储备液（100 μg/mL）：准确称取约10.0 mg 氟苯尼考标准物质（精确到0.1 mg）于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成100 μg/mL 标准储备液（-20 ℃保存4个月）。

标准中间液（1 000 ng/mL）：准确移取标准储备液（100 μg/mL）1 mL 于100 mL 容量瓶中，用20%甲醇定容至刻度，配制成1 000 ng/mL 标准中间液（现配现用）。

标准工作液（5 ng/mL）：准确移取标准中间液（1 000 ng/mL）1 mL 于200 mL 容量瓶中，用20%甲醇定容至刻度，配制成5 ng/mL 标准工作液（现配现用）。

1.4.2 提取 称取样品5 g（±0.01 g）置于50 mL离心管中，加标准工作液100 μL（100 ng/mL）、氨水0.25 mL、乙酸乙酯7.5 mL，涡旋振荡10 min，8 000 r/min 离心5 min，将上层乙酸乙酯转移至另一50 mL 离心管中。再加氨水0.25 mL、乙酸乙酯7.5 mL，涡旋振荡10 min，8 000 r/min 离心5 min，合并上层液，55 ℃氮气吹干。同时制作阳性对照样品，在5 g（±0.01 g）空白样品中加标准中间液100 μL（100 ng/mL），添加浓度为2.0 μg/kg（上机浓度为5 ng/mL）。

1.4.3 净化 加正己烷2 mL 轻轻涡旋混匀，加20%甲醇2.0 mL 用手摇匀（注：若有乳化，取下清液于1.5 mL离心管中21 000 r/min离心；或者放入氮吹仪中加热5 min），14 000 r/min 离心5 min，取下清液（用1 mL注射器吸取）过滤膜（若浑浊就再过一次）后供LC-MS/MS检测。

1.4.4 定量方法 基质单点，按外标法以峰面积计算，计算公式如下：

式中，A为供试溶液中氟苯尼考的峰面积；AS为标准品溶液氟苯尼考的峰面积；CS为标准溶液浓度（ng/mL）；V为定容体积（mL）；m为称样量（g）。

2 注意事项

蛋类有时会产生乳化现象，吸取的上清液体积往往少于加入的乙酸乙酯体积，如果提取一遍，用外标法校正时会导致回收率偏低，故可以重复提取一次，使得提取更加完全；脱脂时应轻摇，避免用力过大造成乳化；高速冷冻离心的时候应该选用质量好的离心管，普通国产离心管在高速离心时可能会碎裂；过滤时用注射器小心吸取离心后的下清液，尽量避免吸到沉淀和上浮的杂质，普通国产滤膜即可达到效果，个别浑浊的可用进口滤膜过滤。

3 结果分析

本方法依据《GB/T 22338-2008 动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》提出了较多的改进。国标中涉及的检测对象为动物组织、肝肾、水产品及蜂蜜，没有专门针对鸡蛋的前处理方法。本次在国标方法的基础上专门针对鸡蛋给出了具体前处理方法。在提取过程中，国标方法用乙腈饱和正己烷、正丙醇、丙酮-正己烷等试剂多次提取转移，相对于国标方法本试验提取过程中仅用到了氨水、乙酸乙酯，提取过程简易清晰，提取充分。国标方法的净化过程要使用LC-Si 硅胶小柱、旋蒸仪、氮吹仪及丙酮正己烷淋洗、洗脱，而本改进方法中净化过程不用硅胶小柱、旋蒸、氮吹，仅使用20%甲醇复溶和离心机。在同样添加浓度为2.0 μg/kg 情况下，国标方法回收率在70%～90%之间，而本试验方法回收率达到100%～110%，平行样间结果相对标准偏差0.96%，实验室间结果相对标准偏差5.4%，检测限为0.1 μg/kg。

综上，本次改进方法的前处理过程简单、高效、准确，大大提高了工作效率；对人体有害的有机试剂使用较少；节省实验耗材，减少前处理设备的使用。在社会效益与经济效益上具有不可估量的作用。