白薇对LPS诱导的鸡小肠损伤及炎症因子的表达

李秋月，韦东来，贺尚文，张 慧，侯思鲁，徐媛媛，穆 祥，董 虹

(北京农学院 动物科学技术学院，兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京102206)

脂多糖(Lipo-polysaccharide，LPS)，可引起全身性炎症反应和严重的败血症，常用于制造各种炎症模型，诱发机体炎症反应[1, 2]。研究表明，注射LPS后会影响鸡空肠紧密连接蛋白和粘蛋白的表达，损伤肠道的渗透性和屏障功能[3]，降低小肠的湿重，肠绒毛高度和小肠吸收能力[4]。目前常用的治疗方法就是使用抗生素，但在牲畜日粮中过量的使用抗生素会导致越来越多耐药菌的出现。

白薇最初记载于《神农本草经》，其主要由白薇素、多糖苷等组成，具有解毒疗疱，退热抗炎等功效[5, 6]。含白薇的清营解表药物，可以缓解患有病毒性流感小鼠的症状，肺部组织病理变化，巨噬细胞的吞噬功能和小鼠淋巴细胞的增殖能力[7]。利用白薇替代抗生素后可增强肉鸡的生长性能，增加其心、肝、脾的抗氧化能力和肠道微生物的菌群丰富度[8]。白薇还可以降低小鼠耳廓肿胀的程度[9]。故本试验使用LPS造炎症模型，考察通过白薇水煎液预处理后对LPS引起的炎症的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材 料

LPS购于Sigma公司；白薇购于北京同仁堂；SAA、OVT、AGP、IL-1β试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司；2日龄健康肉鸡购于北京爱拨益加家禽育种有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 动物分组及给药 将60只2日龄肉鸡分为生理盐水组，LPS组，白薇水煎液(3、6、9 g/kg)组。适应性喂养至28日龄。开始灌服给药，每天1次，连续3 d。于第3 天灌胃前3 h按2 mg/kg剂量腹腔注射大肠杆菌LPS。

1.2.2 样本采集 于腹腔注射3 mg/kg的LPS，12 h后采取鸡翅隐静脉采血分离血清备用。剖取十二指肠剪成1 cm左右的组织块，用4%的甲醛固定备用。

1.2.3 指标检测 用ELISA试剂盒检测鸡血清中SAA、OVT、AGP、IL-1β的浓度，各指标具体操作按照说明书进行。

试验结果采用Graphpad Prism8.2.1统计软件处理数据，所有数据采用±标准差表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，为差异有统计学意义。

2 结果分析

2.1 病理组织切片结果

从小肠HE染色切片中可以观察到，生理盐水组中，小肠绒毛组织结构完整，黏膜上皮细胞排列整齐(图1-A)。LPS导致雏鸡小肠绒毛黏膜上皮组织结构损伤，上皮细胞脱落并伴有炎性细胞浸润，且固有层出现炎症钙化灶(图1-B)，通过组织切片可以观察到白薇水煎液(3、9 g/kg)组 (图1-C，E)对LPS损伤的小肠绒毛起到了保护作用，但白薇水煎液(6 g/kg)组(图1-D)保护小肠绒毛的效果最好。

图1 病理组织切片HE染色

2.2 白薇水煎液对LPS诱导的鸡血清中炎症因子表达的影响

从图2可知，白薇水煎液(3 g/kg)组可降低LPS刺激后SAA表达水平(P<0.05)。白薇水煎液(9 g/kg)组可降低LPS刺激后AGP的表达水平(P<0.01)。而白薇水煎液(6 g/kg)组可有效降低LPS所导致的SAA(P<0.01)、IL-1β(P<0.01)、OVT(P<0.05)、AGP(P<0.001)这4种炎性因子的表达。故由试验可知，白薇水煎液(6 g/kg)组，可降低LPS所导致的SAA、IL-1β、OVT、AGP这4种炎性因子的表达水平。

图2 不同处理组SAA、IL-1β、OVT、AGP的ELISA试剂盒测试结果

3 讨论与结论

肠黏膜在抵抗感染，调节外源抗原引起的免疫反应中起着重要的作用。肠道屏障的功能主要取决于肠道上皮的完整性，完整的肠道屏障可以阻止肠道细菌转移到机体当中[10]。LPS和肠道细菌等促炎性细胞因子的入侵会损害肠道黏膜的通透性和完整性，引起巨噬细胞活化并促进IL-1β及一系列的细胞因子含量的增加，进而导致动物体内SAA、AGP和OVT的变化。在鸡中发现SAA、AGP和OVT在应激或疾病的状态下与健康时相比存在差异[11]。在细菌或病毒感染后可观察到鸡血清中AGP的含量升高[12]。在鸡传染性支气管炎病毒中SAA呈现高表达[13]。禽流感病毒感染早期或用LPS刺激时可观察到OVT蛋白在鸡血清中的含量显著增加[14,15]。

细胞的紧密连接对于维持胃肠道屏障的完整性尤为重要，肠道病原体通过改变细胞骨架或特定的紧密连接蛋白来破坏细胞间的紧密连接[16]。大量研究表明，清热类的中药可以通过保护鸡肠黏膜中淋巴细胞和杯状细胞，来维持肠道屏障的完整性，从而达到保护机体的目的[17]。清热解毒类中草药黄连中的主要成分小檗碱可预防LPS对大鼠回肠绒毛的损伤，阻止LPS对于肠道紧密连接和肠道屏障通透性的破坏，并降低TLR4和NF-κB的活化和IL-1β的表达[18, 19]。清热燥湿类中草药黄芩中的主要成分黄芩苷预处理可降低大鼠结肠炎中炎性细胞浸润和外周血单核细胞数量降低肠道的损伤。其机制是通过抑制LPS诱导的M1巨噬细胞极化，并使巨噬细胞在体外转换为M2表型，通过调节巨噬细胞亚群来抑制炎症，从而减轻大鼠溃疡性结肠炎的症状[20,21]。清热类中药疏风解毒胶囊可以降低动物中SAA的含量的表达[22, 23]。因此本试验使用清热解毒中药白薇水煎液，用LPS制造鸡腹泻模型，研究白薇水煎液对于LPS导致的鸡腹泻的影响，结果表明白薇水煎液可以减轻LPS导致的鸡腹泻症状。进一步研究发现白薇水煎液可有效减少LPS对肠绒毛的损伤作用，减少炎性细胞的浸润，保护肠绒毛的固有形态。SAA、OVT、AGP、IL-1β这四种炎性因子在LPS刺激后均会高于对照组。但各炎症因子差异不一，导致这一现象的原因可能为各炎症因子表达量峰值不同，其中SAA在感染后12 h达到峰值，OVT在24 h达到峰值，而AGP在12 h达到峰值，并且宿主在LPS注射72 h后恢复稳态[24]。从试验结果可以看出，白薇水煎液(6 g/kg)组能降低SAA、OVT、AGP、IL-1β 4种炎症因子表达，并可保护LPS所导致的肠黏膜损伤，其原因可能为白薇具有清热解毒、退热抗炎的作用。