针刺调控miR-128-3p对卒中大鼠神经功能及Nrf2表达影响

黄秀容,张子强,赖名殷,余瑾,袁青

(1.深圳市人民医院,深圳 518001;2.广州中医药大学针灸康复临床医学院,广州 510405)

卒中在临床中又被称为中风,是神经系统主要疾病之一,其中 80%以上为缺血性卒中,该病致死率及致残率高,治疗周期长,预后差,多数患者会留下活动及语言功能丧失、偏瘫等后遗症,使患者生活信心丧失,造成极大的身心损伤,并给其家庭和社会带来沉重的经济负担[1-2]。针灸治疗卒中具有良好的疗效,一直是临床研究的重点,其与高压氧、康复训练联合综合治疗,可协同改善卒中患者吞咽障碍[3];与PNF康复技术联合治疗卒中偏瘫患者,可有效促进其上肢运动功能恢复,提高患者的生活质量[4],但其具体作用机制目前还未阐释清楚。小胶质细胞激活诱导的神经炎症是局灶性缺血性卒中的主要致病基础[5],miR-128-3p可调控炎症反应,下调 miR-128-3p表达,可通过抑制核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路活性而显著减弱炎症反应[6],且 miR-128b在脑梗死患者血清中高表达,与患者脑梗死严重程度呈正相关,是脑梗死的危险因素[7]。另外,红系衍生的核转录相关因子(nuclear factor erythroid-derived 2-like 2,Nrf2)是炎症及氧化应激的负调控因子,上调 Nrf2表达,可抑制小胶质细胞激活,减轻脑损伤[8]。然而针刺是否通过调控miR-128-3p改善卒中大鼠的神经功能及对Nrf2表达的影响目前还未见研究,本文通过建立脑缺血再灌注大鼠模型,对此进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠(康美华大基因技术有限公司),清洁级,动物生产许可证号 SCXK(粤)2019-0027,动物使用许可证号 SYXK(粤)2019-0137,动物质量合格证号0019012317,雄性,体质量(200±20)g,所有大鼠在本院动物房中饲养,适应 1周后进行实验。饲养条件为12 h/12 h交替照明,大鼠自由饮食、饮水,动物房环境应清洁、安静、通风良好,温度为(25±1)℃,相对湿度为(50±5)%。

1.2 主要试剂及仪器

华佗牌针灸针(0.25 mm×15 mm,190617,苏州医疗用品有限公司);miR-128-3p agomir、miR-128-3p agomir阴性对照(C0719、C0811,上海吉玛制药技术有限公司);大鼠S100β ELISA试剂盒(YS04063B,上海雅吉生物科技有限公司);NSE ELISA试剂盒(SBJ-R0081,南京森贝伽生物科技有限公司);大鼠IL-6 ELISA试剂盒、TNF-α ELISA试剂盒、GAPDH一抗、兔源Nrf2一抗、羊抗兔二抗(ab100772、ab100785、ab181602、ab137550、ab150077,Abcam公司);RNAiso Plus、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(9108、RR037Q/A/B、639519,Takara公司);蛋白提取试剂盒(C006325-0150,上海生工生物工程股份有限公司);BCA试剂盒、苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色试剂盒(P0011、C0105,上海碧云天生物技术有限公司);光学显微镜(SMZ745,尼康公司);切片机(CM3050S,Leica公司,德国);酶标仪(XElx800,Perkin Elmer公司);高通量DNA合成仪(3900,应用生物系统公司);凝胶成像系统(2500,上海天能公司)。

1.3 模型制备及分组

参考文献中方法[9]制备 MACO模型,具体为腹腔注射45 mg/kg剂量的2.5%戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠,仰卧固定在操作台后,消毒、颈部备皮、铺巾,逐层打开颈部,钝性分离大鼠左侧颈总动脉(common carotid artery,CCA)、颈外动脉(external CA,ECA)、颈内动脉(internal CA,ICA),并以缝合线结扎 CCA、ECA近心端,同时以动脉夹夹闭ICA,于CCA分叉部4 mm处剪一小口,将一根直径为 0.24 mm栓线插入 CCA直到ICA,使大脑中动脉血流受阻,将拴线尾端部分固定于皮肤外后逐层缝合切口,2 h后抽出栓线即完成模型制备。观察大鼠活动情况,根据Longa分级法[10]对其神经功能缺损进行评分,标准如下,无神经功能缺损,0分;不能完全伸展对侧前爪,1分;行走向对侧转圈,2分;行走向对侧倾倒,3分;意识丧失,不能自发行走,4分;死亡,5分。当评分达到1～3分时表示模型制备成功[10],共制备65只,成功60只,随机分为模型组、激动剂组、激动剂阴性对照组、针刺组、针刺＋激动剂组,每组12只。另取12只大鼠仅分离CCA、ECA、ICA后缝合伤口,其他操作相同,设为假手术组。

参照文献[11]针刺组、针刺＋激动剂组大鼠于双侧阳陵泉穴及曲池穴行针(参照《实验针灸学》“动物针灸穴位图谱”及解剖学方法进行大鼠穴位定位),每10 min行针1次,捻转角度180°,频率每分钟80次,力度均匀适中,每次行针持续 1 min,共留针 30 min,每日1次,持续治疗7 d。参照说明书及文献[12],以生理盐水溶解miR-128-3p agomir、miR-128-3p agomir阴性对照配制为终浓度 20 μM的溶液,以 5 mL/kg剂量对激动剂组、激动剂阴性对照组、针刺＋激动剂组大鼠进行尾静脉注射,假手术组、模型组和针刺组尾静脉注射等剂量生理盐水,每日1次,持续7 d。

1.4 指标检测

1.4.1 大鼠神经功能损伤检测及标本收集

末次给药24 h后,对各组大鼠进行神经功能缺损评分,然后尾静脉取血 4 mL,静置后离心,取上清液即为血清,储存在﹣80℃备用。将大鼠麻醉后处死,解剖后获得脑皮质组织,部分分装为0.5 g/管,置于液氮中速冻10 min后,移至﹣80℃保存备用;部分脑皮质组织以生理盐水漂洗干净,置于 4%多聚甲醛溶液中固定,使用低浓度到高浓度梯度乙醇依次处理脱水,经二甲苯透明、石蜡包埋后,采用切片机做病理切片备用。

1.4.2 大鼠脑皮质组织病理损伤检测

选取完整的脑皮质切片,经脱蜡、高浓度到低浓度梯度乙醇浸泡处理后,参照HE试剂盒说明书的步骤进行HE染色,再次脱水、透明后封片,使用光学显微镜观察大鼠脑皮质组织病理变化,任选5个视野进行拍照。

1.4.3 大鼠血清S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平检测

血清置于4℃冰箱中解冻,以大鼠ELISA试剂盒检测其中 S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平,具体操作如下。将梯度稀释的标准品及样品分别加入酶标板孔内,每孔 100 μL,封孔后置于 37℃孵育 90 min,洗板 3次;然后分别添加生物素抗体溶液,每孔 100 μL,置于37℃孵育45 min,洗板3次;再分别添加酶反应底物溶液,每孔100 μL,37℃避光孵育15 min;加入反应终止液 50 μL,采用酶标仪检测各孔在 450 nm下吸光值(optical density,OD),绘制标准品浓度与OD值曲线图,根据样品OD值计算其浓度。

1.4.4 大鼠脑皮质组织miR-128-3p、Nrf2 mRNA水平检测

取脑皮质组织 0.5 g粉碎后,加入 RNAiso Plus混匀后,参照其说明书的操作步骤提取总 RNA,然后以逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒将其逆转录后进行荧光定量PCR反应,反应体系如下。SYBR® Premix EX Taq TMⅡ(2×)10 μL,上下游引物各 1 μL,cDNA 1.5 μL,无菌水6.5 μL,总计20 μL。反应条件为95℃ 30 s,1个循环;95℃ 5 s,60℃ 30 s,40个循环。miR-128-3p、U6、Nrf2、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以U6为miR-128-3p的内参,以GAPDH为Nrf2的内参,采用 2﹣ΔΔ3)t算法对所得实验数据进行计算分析,进而得到各组大鼠 miR-128-3p、Nrf2 mRNA相对表达量,各基因引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.4.5 大鼠脑皮质组织Nrf2蛋白表达检测

取0.5 g脑皮质组织粉碎后,加入蛋白裂解液混匀制备为匀浆液,离心后取上清液,获得总蛋白样品液,采用BCA试剂盒测量蛋白总浓度,煮沸变性后,各组取含相同质量总蛋白的样品液上样,进行电泳使蛋白分离,然后将其转移至PVDF膜上,置于5%脱脂奶粉溶液中室温封闭,根据目的蛋白分子量截取蛋白条带置于孵育盒中,分别加入兔源一抗 GAPDH(1:1000)、Nrf2(1:500),于 4℃冰箱中孵育过夜,经 TBST漂洗 3次,加入羊抗兔二抗(1:2000),于摇床上室温孵育2 h,经TBST再次漂洗3次,采用增强化学发光法显色,使用凝胶成像系统对蛋白条带进行拍照,并以 Quantity One软件分析图像,得到各组蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法

实验数据采用SPSS24.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示。符合正态分布和方差齐性的计量资料,组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验;若不符合则采用Kruskal-Wallis检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能比较

与假手术组相比,模型组大鼠神经功能缺损评分明显升高(P＜0.05)。与模型组相比,激动剂组大鼠神经功能缺损评分升高(P＜0.05),激动剂阴性对照组大鼠无明显变化(P＞0.05),针刺组大鼠神经功能缺损评分降低(P＜0.05)。与针刺组比较,针刺＋激动剂组大鼠神经功能缺损评分升高(P＜0.05)。与激动剂组比较,针刺＋激动剂组大鼠神经功能缺损评分降低(P＜0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠神经功能缺损评分比较 (±s,分)

表2 各组大鼠神经功能缺损评分比较 (±s,分)

注:与假手术组比较 1)P＜0.05;与模型组比较 2)P＜0.05;与针刺组比较3)P＜0.05;与激动剂组比较4)P＜0.05

组别 n 神经功能缺损评分假手术组 12 0模型组 12 2.46±0.431)激动剂组 12 3.62±0.352)激动剂阴性对照组 12 2.48±0.411)针刺组 12 0.18±0.052)针刺＋激动剂组 12 2.53±0.521)3)4)

2.2 各组大鼠脑皮质组织病理学形态

假手术组大鼠脑皮质中神经元无病理损伤。模型组大鼠脑皮质中神经元呈现细胞核收缩变小、细胞坏死、数量减少等病理损伤。与模型组相比,针刺组大鼠脑皮质中神经元病理损伤减轻,激动剂组大鼠脑皮质中神经元病理损伤加重,激动剂阴性对照组大鼠无明显变化。与针刺组比较,针刺＋激动剂组大鼠脑皮质中神经元细胞核皱缩、细胞坏死等病理损伤加重。与激动剂组比较,针刺＋激动剂组大鼠脑皮质中神经元上述病理损伤减轻。详见图1。

图1 各组大鼠脑皮质组织HE染色结果(×200)

2.3 各组大鼠血清 S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平比较

与假手术组相比,模型组大鼠血清 S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平明显升高(P＜0.05)。与模型组相比,针刺组大鼠血清 S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平降低(P＜0.05),激动剂组大鼠血清 S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平升高(P＜0.05),激动剂阴性对照组大鼠无明显变化(P＞0.05)。与针刺组比较,针刺＋激动剂组大鼠血清 S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平升高(P＜0.05)。与激动剂组比较,针刺＋激动剂组大鼠血清S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平降低(P＜0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠血清中S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平比较 (±s)

表3 各组大鼠血清中S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平比较 (±s)

注:与假手术组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05;与针刺组比较3)P＜0.05;与激动剂组比较4)P＜0.05

组别 n S100β(ng/mL) NSE(ng/mL) IL-6(pg/mL) TNF-α(pg/mL)假手术组 12 6.15±1.03 72.83±12.07 33.02±2.26 36.03±2.43模型组 12 76.37±9.981) 151.87±25.611) 76.95±5.321) 81.63±5.271)激动剂组 12 119.67±20.572) 203.12±40.532) 110.07±20.342) 127.43±24.182)激动剂阴性对照组 12 76.84±10.121) 152.43±26.011) 77.24±6.211) 83.21±18.341)针刺组 12 6.89±1.092) 75.19±12.562) 34.39±2.352) 37.12±2.642)针刺＋激动剂组 12 79.23±10.451)3)4) 155.37±27.231)3)4) 78.12±6.541)3)4) 82.73±6.321)3)4)

2.4 各组大鼠脑皮质组织 miR-128-3p、Nrf2 mRNA水平比较

与假手术组相比,模型组大鼠脑皮质组织 miR-128-3p水平明显升高(P＜0.05),Nrf2 mRNA水平明显降低(P＜0.05)。与模型组相比,针刺组大鼠脑皮质组织miR-128-3p水平降低(P＜0.05),Nrf2 mRNA水平升高(P＜0.05);激动剂组大鼠脑皮质组织 miR-128-3p水平升高(P＜0.05),Nrf2 mRNA水平降低(P＜0.05);激动剂阴性对照组大鼠无明显变化(P＞0.05)。与针刺组比较,针刺＋激动剂组大鼠脑皮质组织 miR-128-3p水平升高(P＜0.05),Nrf2 mRNA水平降低(P＜0.05)。与激动剂组比较,针刺＋激动剂组大鼠脑皮质组织miR-128-3p水平降低(P＜0.05),Nrf2 mRNA水平升高(P＜0.05)。详见表4。

2.5 各组大鼠脑皮质组织中Nrf2蛋白表达

与假手术组相比,模型组大鼠脑皮质组织中 Nrf2蛋白表达明显降低(P＜0.05)。与模型组相比,针刺组大鼠脑皮质组织中 Nrf2蛋白表达升高(P＜0.05),激动剂组大鼠脑皮质组织中 Nrf2蛋白表达降低(P＜0.05),激动剂阴性对照组大鼠无明显变化(P＞0.05)。与针刺组比较,针刺＋激动剂组大鼠脑皮质组织中Nrf2蛋白表达降低(P＜0.05)。与激动剂组比较,针刺＋激动剂组大鼠脑皮质组织中 Nrf2蛋白表达升高(P＜0.05)。详见图2、表5。

表4 各组大鼠脑皮质组织miR-128-3p、Nrf2 mRNA水平比较 (±s)

表4 各组大鼠脑皮质组织miR-128-3p、Nrf2 mRNA水平比较 (±s)

注:与假手术组比较 1)P＜0.05;与模型组比较 2)P＜0.05;与针刺组比较3)P＜0.05;与激动剂组比较4)P＜0.05

组别 n miR-128-3p/U6 Nrf2/GAPDH假手术组 12 0.98±0.20 0.99±0.23模型组 12 2.15±0.431) 0.59±0.051)激动剂组 12 3.07±0.742) 0.23±0.542)激动剂阴性对照组 12 2.14±0.511) 0.57±0.071)针刺组 12 1.03±0.232) 0.95±0.162)针刺＋激动剂组 12 2.12±0.531)3)4) 0.56±0.081)3)4)

图2 各组大鼠脑皮质组织中Nrf2蛋白表达

表5 各组大鼠脑皮质组织中Nrf2蛋白相对表达比较 (±s)

表5 各组大鼠脑皮质组织中Nrf2蛋白相对表达比较 (±s)

注:与假手术组比较 1)P＜0.05;与模型组比较 2)P＜0.05;与针刺组比较3)P＜0.05;与激动剂组比较4)P＜0.05

组别 n Nrf2/GAPDH假手术组 12 0.73±0.13模型组 12 0.38±0.091)激动剂组 12 0.10±0.032)激动剂阴性对照组 12 0.36±0.081)针刺组 12 0.72±0.152)针刺＋激动剂组 12 0.37±0.071)3)4)

3 讨论

近年随着社会的发展,卒中发病率逐年升高,并趋于年轻化,然而患者治愈率低,且大多存在各种后遗症,其中约 33.3%的患者会遗留永久残疾,一直是临床研究的热点及难点[13-14]。研究发现,兴奋性毒性、炎症反应、氧化应激是缺血性卒中的主要病理过程,缺血缺氧及血液再灌注可激活神经胶质细胞,大量合成促炎因子白介素(interleukin,IL)-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α释放进入血液,引发机体炎症反应,影响卒中发生发展[15-18]。另外,缺血再灌注可致血脑屏障受损,进一步导致星形胶质细胞标志蛋白S100β及神经组织中神经元特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase,NSE)进入血液,因而血清S100β、NSE水平可作为反映脑损伤的敏感指标[19]。本研究以大脑中动脉线栓法建立脑缺血再灌注大鼠模型,结果显示,模型组大鼠脑皮质神经元呈现细胞核收缩变小、细胞坏死等病理损伤,且神经功能缺损评分显著高于假手术组,表明模型建立成功。本研究还发现,与假手术组比较,模型组大鼠血清中 S100β、NSE、IL-6及TNF-α水平明显升高,提示模型组大鼠存在一定程度炎症反应。

针刺是中医常规治疗方法,目前已成为临床治疗卒中的常用手段,针刺可降低急性缺血性卒中患者血清炎性因子水平,抑制其炎症反应,改善卒中后上肢痉挛等临床症状[20-21]。检索文献发现,阳陵泉穴、曲池穴被用于卒中治疗较多,《针灸大成》:“阳陵泉穴主膝股内外廉不仁,偏风半身不遂。”《医宗金鉴》:“曲池主治卒中,手挛急痛痹风。”现代医学研究发现,针刺卒中患者阳陵泉穴可显著降低执行控制网络功能连接度,有利于患者脑功能及运动功能恢复[22]。针刺缺血再灌注大鼠曲池穴可抑制大脑皮质中神经细胞凋亡,改善神经功能评分[23]。因此,本研究对缺血性卒中大鼠双侧阳陵泉穴、曲池穴进行针灸,结果显示,与模型组比较,针刺组大鼠脑皮质病理损伤减轻,神经功能缺损评分及血清中S100β、NSE、IL-6及TNF-α水平显著降低,表明针刺可减轻缺血性卒中大鼠脑组织损伤,降低大鼠炎症反应,恢复神经功能,然而其具体的分子机制不清楚。

miR-128-3p可参与调控机体炎症、氧化应激等生理过程[24-27],风湿性关节炎患者血清 miR-128-3p及IL-6等炎症因子水平显著升高,下调miR-128表达可抑制T细胞释放炎症因子[6]。Shyamasundar S等[28]发现,miR-128过度表达可增强肾脏细胞促炎因子表达,促使肾组织炎症进展。Nrf2介导抗氧化信号通路,上调其表达可抑制氧化应激损伤,促使成人神经干细胞成活及增殖,增强成人神经干细胞替代疗法对卒中患者脑组织的保护作用[29-31]。Zhou F等[32]研究发现,五味子甲素可通过激活Nrf2通路降低IL-6、TNF-α等促炎因子表达,抑制氧化应激反应,从而保护缺血再灌注脑损伤。本研究发现,与模型组比较,针刺组大鼠脑皮质组织miR-128-3p水平降低,Nrf2 mRNA及蛋白水平升高,表明针刺可能通过下调 miR-128-3p表达,上调Nrf2表达,抑制炎症发生,从而减轻缺血再灌注所致脑损伤。为进一步探讨miR-128-3p在针刺治疗卒中的作用,本研究采用激动剂过表达 miR-128-3p,结果发现,与针刺组比较,针刺＋激动剂组大鼠脑皮质组织miR-128-3p水平升高,Nrf2 mRNA及蛋白水平降低,大鼠脑皮质病理损伤加重,神经功能缺损评分及血清中S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平显著增高,表明针刺对miR-128-3p表达的下调作用及对缺血再灌注大鼠脑损伤的保护作用可被miR-128-3p激动剂逆转,进一步提示针刺可能通过下调 miR-128-3p表达改善缺血性卒中大鼠神经功能。

综上所述,针刺可能通过下调 miR-128-3p表达,促进 Nrf2表达,抑制炎症反应,从而减轻缺血性卒中大鼠脑损伤,改善其神经功能,为采用针刺疗法改善缺血性卒中患者神经功能提供一定参考依据。但本文只对其进行了初步探讨,关于针刺对Nrf2信号通路下游分子的调控作用及miR-128-3p是否可靶向调节Nrf2表达均未涉及,将在后续进行更深入研究,以进一步阐释针刺治疗卒中的具体机制。