滇红茶加工过程中氟虫腈及其代谢物降解规律分析及膳食暴露评估

林 涛,彭丽媛,陈兴连,刘兴勇,李茂萱,徐祎然,邹艳虹,刘宏程,*

(1.云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所,云南昆明 650205; 2.农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(昆明),云南昆明 650205; 3.云南省临沧市凤庆县农产品质量安全检测站,云南凤庆 675900; 4.云南省昆明市动物疫病预防控制中心,云南昆明 650033)

红茶作为我国的传统饮用植物之一,属全发酵茶,经萎凋、揉捻、发酵、干燥等系列工艺加工而成[1]。滇红茶作为云南省红茶的代表,在全国甚至世界上都享有盛誉,也是我国茶叶出口中的主要种类之一[2]。农药残留一直是茶叶质量安全重点关注的对象,近年来,红茶中的农药残留也不断引起社会的广泛关注[3-5],而红茶因其加工工艺相对简单,相关的农药在其加工过程中的残留变化规律目前尚不明确,缺乏必要的基础数据。

目前,红茶中使用的农药种类较多,但是我国的限量标准GB 2763-2019[6]中只针对茶叶中的苯醚甲环唑、吡虫啉、哒螨灵、啶虫脒、多菌灵等65种农药残留进行了规定,远小于红茶中检出的农药种类。氟虫腈作为苯基吡唑类杀虫剂的代表,具有广谱杀虫效果,其对水生生物以及蜜蜂具有一定的毒性,我国农业部已于2009年禁止其用于茶叶及蔬菜水果的种植过程中[7],然而,根据本实验室近年来对于红茶的监控数据显示,红茶中的氟虫腈在近年来时有检出,但其来源不明,可能为隐性农药添加或者其在土壤长期残留后随茶树的代谢进入其叶片中,且在红茶加工过程中的残留降解变化规律不明确,需进一步系统研究。

基于此,本研究以滇红茶为研究对象,通过对叶片外源喷洒氟虫腈及其代谢物,采摘后监测其加工过程中氟虫腈及其代谢物的残留变化,并基于其中的氟虫腈及其代谢物残留量,对其降解变化规律及膳食评估进行研究,为科学引导消费和农药的科学评估提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

滇红茶茶树(大叶种) 云南省临沧市凤庆县;Cleanert TPT固相萃取柱 天津博纳艾杰尔科技有限公司;氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜标准物质(1000 μg/mL) 农业部环境保护科研监测所;甲醇、乙腈(色谱纯) 德国merck公司;甲苯(优级纯)、氯化钠(分析纯)、无水硫酸钠(分析纯) 国药集团化学试剂北京有限公司;纯净水 杭州娃哈哈集团。

API 5500 Q TRAP三重四极杆质谱仪 美国AB SCIEX公司;1290Ⅱ型超高效液相色谱仪、ZORBAX RRHD C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm) 美国Agilent公司;AE-100型电子分析天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;涡旋振荡器 美国Thermo Scientific公司;TGL-15B型高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂;HY-5型回旋式振荡仪 江苏省金坛市环宇科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 氟虫腈及其代谢物测定

1.2.1.1 标准溶液配制 准确吸取1.00 mL氟虫腈及其3种代谢物标准物质,用甲醇稀释成浓度为10.0 mg/L的标准储备液。再准确量取一定体积的氟虫腈及其3种代谢物标准储备溶液,用甲醇稀释得到0.100 mg/L标准工作溶液,于-20 ℃下保存。

1.2.1.2 色谱条件 采用甲醇和水溶液作为流动相,流速:0.20 mL/min;柱温:35 ℃;进样量:1.00 μL,梯度洗脱参数见表1。

表1 梯度洗脱参数Table 1 The parameters of gradient elution

1.2.1.3 质谱条件 采用ESI源,负离子扫描;MRM监测模式。相关气体条件为:GS1雾化气55 L/h;GS2辅助加热气55 L/h;气帘气20 L/h;喷雾电压-5500 V;辅助加热气温度550 ℃;氟虫腈及其代谢物的离子对条件如表2所示。

1.2.1.4 样品制备 滇红茶的加工方法参照NY/T 780-2004(红茶)[8],滇红茶鲜叶以及经过萎凋、揉捻、发酵3个加工工序得到的半成品样品中含水量较大,故按照鲜样进行样品制样,即将所取样品经匀浆机匀浆后待测;滇红茶经晒干后的样品因其含水量较低,故直接经粉碎机粉碎,过0.3 mm筛,待测。

1.2.1.5 样品前处理 参照文献[9-10]中的步骤并做适当改进,根据滇红茶加工过程中不同工序中含水量的不同,分别称取5.00 g样品于50 mL离心管中,鲜叶以及经萎凋、揉捻、发酵3个加工工序得到的半成品样品加入5.00 mL纯净水,而滇红茶经晒干后的样品中加入10.0 mL纯净水,涡旋振荡1.00 min,再静置10.0 min后加入20.0 mL乙腈,利用高速匀浆机12000 r/min充分匀浆2.00 min,再加入2.00 g氯化钠,涡旋振荡5.00 min,在5000 r/min下离心5.00 min,取上清液5.00 mL,待净化。

表2 氟虫腈及其代谢物的离子对条件及相关参数Table 2 Ion pair conditions and related parameters for determination of fipronil and its metabolites

1.2.1.6 样品净化 滇红茶样品基质复杂,易对测定仪器造成污染,故本试验中采用TPT固相萃取柱参照文献[11-12]的方法对滇红茶提取溶液进行净化,首先用乙腈-甲苯(3∶1)5.00 mL活化TPT固相萃取柱,样品提取液5.00 mL上样后,10.0 mL乙腈-甲苯(3∶1)洗脱,洗脱液40 ℃氮气在下吹干后1.00 mL甲醇定容,过滤膜待分析。

1.2.2 氟虫腈及其代谢物残留降解试验 选择晴朗的天气进行残留试验,试验当天风速为1.2 m/s,气温为23.5 ℃,喷洒时间为下午14点左右,选取10株生长状况良好的滇红茶茶树,在其鲜叶上喷洒经水溶液稀释的氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈亚砜混合溶液,浓度均为2 μg/mL,共喷洒200 mL,喷洒后24 h采摘,采摘方法参照NY/T 788-2018(农作物中农药残留试验准则)[13],采摘量约为5 kg,其后分别于滇红茶加工过程的萎凋、揉捻、发酵、干燥4个工序后取样,每个工序取样200 g,并设置3个平行,取样后及时于-20 ℃冰箱中保存,待制样和测定。同时设置对照组,对照组不喷洒农药,其他操作与试验组相同。通过测定鲜叶及萎凋、揉捻、发酵、干燥4个工序中氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈亚砜的含量,结合每一工序中样品的含水量测定(测定方法参照GB 5009.3-2016 食品安全国家标准 食品中水分的测定[13]),统一换算为干样中氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈亚砜含量,计算降解率,降解率计算方法为:(样品原始浓度-每次所得含量)/样品原始浓度,寻找各农药在加工过程中的降解变化规律。

1.2.3 滇红茶中氟虫腈及其代谢物膳食评估

1.2.3.1 滇红茶中氟虫腈及其代谢物的各化合物的单一危害 参照文献[14-16]中的评估方法,计算各化合物的危害商HQ,当HQ计算结果>1时,则表明膳食暴露风险较大,反之当HQ<1时,则表明膳食暴露风险较低。HQ的具体计算方法如下:

其中,残留量采用滇红茶最终产品中的氟虫腈及其代谢物含量(mg/kg),参照文献[17]及国家食品安全风险评估委员会的规定,平均膳食量按13 g/d计算,平均体重按60 kg计算,ADI(mg/kg·bw)采用《GB 2763-2019 食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》[6]中的数据为0.0002 mg/kg·bw。

1.2.3.2 滇红茶中氟虫腈及其代谢物的总危害 采用各化合物的危害指数(HI)进行评估,同样,当HI>1时,则表明总的膳食暴露风险较大,反之当HI<1时,则表明总的膳食暴露风险较低。HI的计算方法如下:

1.3 数据处理

利用AB analyst分析软件对数据进行相关的分析,其他的试验数据利用Microsoft Excel软件进行相关的统计分析,同时绘制相应的线性范围工作曲线等。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

质谱条件是超高效液相色谱-串联质谱仪中最关键的一个条件,氟虫腈及其代谢物在正负离子模式下都有一定的响应,相关文献中也有报道[18-20]。本试验中参考相关文献的报道,同时根据本实验室仪器的实际情况,分别比较了正负离子下氟虫腈及其代谢物的响应情况,结果表明,氟虫腈及其代谢物在负离子模式下具有较强的响应,因其化学结构中都含有的氨基结构,在水溶液环境中,氨基中的N原子上的孤对电子易与外界环境中的H+结合后呈碱性,一般情况下,碱性化合物易在负离子模式下电离,因此,本试验中选择负离子模式对氟虫腈及其代谢物进行测定,同时也对相关的离子对组合和电压等相关参数进行优化,结果如表2所示。

一般情况下,在正离子模式下,流动相中加入甲酸、乙酸铵等可提高正离子化效率,负离子模式下加入氨水以提高pH可以提高负离子效率[21-22],针对氟虫腈及其代谢物的化学结构,其在C18色谱柱上的保留较好,采用甲醇-水作为流动相能够达到较好的分离效果,无拖尾及宽峰现象,而氨水的加入对于氟虫腈及其代谢物的离子化效率并未明显增强。因此,本试验采用负离子模式,选择甲醇-水作为流动相,且无须在流动相中加入铵盐或者酸性化合物。因氟虫腈及其代谢物的极性偏小,故试验组选择甲醇的初始梯度为65%,采用梯度洗脱的方式,氟虫腈及其代谢物得到了较好的分离,峰形较好,结果如图1所示。

图1 氟虫腈及其代谢物标准的提取离子对色谱图(浓度50 ng/mL)Fig.1 Standard chromatogram of extracted ion pair chromatograms of fipronil and its metabolites(concentration of 50 ng/mL)注:A、B、C和D分别为氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈亚砜。

表3 氟虫腈及其代谢物的线性范围、决定系数(R2)、检出限和定量限Table 3 Linear ranges,determination coefficients(R2),limits of detection(LODs)and limits of quantitation(LOQs)of fipronil and its metabolites

2.2 氟虫腈及其代谢物测定方法学考察

2.2.1 线性范围和灵敏度 将氟虫腈及其代谢物分别用甲醇稀释成不同的浓度,分别进样,进行线性回归,得到其线性范围并计算相关系数;同时利用滇红茶空白样品基质,分别添加不同浓度的氟虫腈及其代谢物,通过不断地降低所添加的氟虫腈及其代谢物浓度,直至其出峰达到3倍和10倍信噪比(S/N),所对应的加标浓度即为其检出限和定量限。实验结果表明,氟虫腈及其代谢物在0.5～100 μg/mL的浓度范围内线性关系较好,R2大于0.9991,检出限为0.4 μg/kg,定量限为1.5 μg/kg。

表4 氟虫腈及其代谢物的回收率和相对标准偏差 Table 4 Recoveries and relative standard deviations of fipronil and its metabolites

本研究中采用了茶叶净化专用柱TPT小柱,结合超高效液相色谱-串联质谱仪,极大地提高了检测灵敏度,达到了痕量检测的要求。

2.2.2 回收率和精密度测定 以市场上销售的滇红茶作为试验对象,根据氟虫腈及其代谢物的定量限,分别以1倍、5倍和10倍定量限作为添加浓度进行加标回收试验,每个添加浓度做6次平行试验。结果如表4所示,不同添加浓度下氟虫腈及其代谢物的回收率范围为84.4%～95.5%,相对标准偏差范围为4.8%～7.4%,符合农药残留测定的要求。

2.3 滇红茶加工过程中氟虫腈及其代谢物降解变化规律

分别对滇红茶加工过程的每个主要步骤中取样,进行氟虫腈及其代谢物的测定,为保证测定结果的一致性和可比性,通过对每个步骤中取样的含水量进行测定,将测定结果换算并以干样计算,测定结果如表5所示,通过对各个步骤中的氟虫腈及其代谢物进行降解折线图的绘制,结果表明,氟虫腈及其代谢物的初始含量大致相同,且随着加工步骤的增多而呈现出含量不断降低的趋势,且降解速率类似,经揉捻后的滇红茶样品中的氟虫腈及其代谢物呈现出明显降低的趋势,其降解率为37.5%～41.2%,随后经发酵步骤后的滇红茶中的氟虫腈及其代谢物的含量变化较小,而经干燥后的滇红茶中氟虫腈及其代谢物的含量又明显降低,氟虫腈及其代谢物经过滇红茶的加工过程后的最终降解率为65.1%～70.1%,初步表明,揉捻和干燥两个步骤中氟虫腈及其代谢物能够大量地降解,推测原因可能为揉捻和干燥两个步骤中的温度较高,高温下易引起氟虫腈及其代谢物的降解,该结论与李栋等[23-26]所述一致。

表5 滇红茶加工过程中氟虫腈及其代谢物含量Table 5 Content of fipronil and its metabolites during processing of black tea

表6 滇红茶中氟虫腈及其代谢物膳食评估Table 6 Dietary evaluation of fipronil and its metabolites in black tea

2.4 滇红茶中氟虫腈及其代谢物膳食评估

根据HQ和HI的计算公式,以滇红茶中的氟虫腈及其代谢物最终含量分别计算相关的危害因子,膳食评估结果如表6所示,氟虫腈及其代谢物的各HQ值均小于1,表明滇红茶中氟虫腈及其代谢物的膳食暴露风险较低;而氟虫腈及其代谢物的总危害指数HI为2.175,大于1,表明膳食暴露风险不可接受,但是该情况是在较大的施药量的条件下,即极端条件下的单种农药的计算值表明膳食暴露风险可接受,同时目前市场上只有氟虫腈农药售卖,其余3种为氟虫腈的代谢物,滇红茶实际生产中不可能同时违禁使用4种氟虫腈类化合物。因此,鉴于氟虫腈及其代谢物已在茶叶中禁止使用,结合滇红茶中氟虫腈及其代谢物的HQ和HI值,初步表明其膳食暴露风险较低,但也应引起重视。

3 结论

利用TPT净化小柱,结合超高效液相色谱-串联质谱,建立了滇红茶中氟虫腈及其代谢物的高灵敏度快速测定方法,在负离子MRM监测模式下,氟虫腈及其代谢物在0.5～100 μg/mL的浓度范围内的线性关系较好,最低检出限为0.4 μg/kg,3个添加浓度下的回收率范围为84.4%～95.5%,相对标准偏差范围为4.8%～7.4%,可满足滇红茶中痕量氟虫腈及其代谢物残留检测的要求。本研究以滇红茶为研究对象,通过在茶树鲜叶上喷洒氟虫腈及其代谢物后采摘,对滇红茶加工过程的每个主要步骤中进行取样并测定氟虫腈及其代谢物含量,结果表明,氟虫腈及其代谢物含量在滇红茶加工过程中随加工步骤的增多而不断降低,揉捻和干燥两个步骤中氟虫腈及其代谢物能够大量地降解;根据最终滇红茶产品中氟虫腈及其代谢物的含量,计算HQ和HI结果表明,氟虫腈及其代谢物的各HQ值均小于1,膳食暴露风险较低,而氟虫腈及其代谢物的总危害指数HI大于1,膳食暴露风险不可接受,但是鉴于氟虫腈及其代谢物已在茶叶中禁止使用,结合滇红茶中氟虫腈及其代谢物的HQ和HI值,初步表明其膳食暴露风险较低。

本研究中所用的危害商HQ主要是基于ADI、平均体重和膳食量进行评估的,主要是基于已有的相关数据和田间试验的残留值所得,但是在实际情况中不同消费群体的体重和膳食量有所差异,而所得的危害商可能也略有不同,在今后的研究中,还需要针对不同消费群体进行相应的系统评估,以期得到更加系统全面的评估结论。