响应面法优化面包果淀粉的酶法提取工艺

钟雪瑶,王少曼,+,张彦军,*,徐 飞,谭乐和,*,于寒松,吴 刚

(1.中国热带农业科学院香料饮料研究所,海南万宁 571533; 2.吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春 130000)

面包果(Artocarpusaltilis)属桑科热带木本粮食作物,原产于太平洋群岛及印度、菲律宾[1],目前主要在我国海南、广东等引种栽培[2]。面包果树每株每季度果实产量可达50～200个[3],是一些热带发展中国家的重要粮食作物资源[4],富含淀粉(12.76%)、膳食纤维(5.19%)、蛋白质(0.95%)和多种人体必需矿物质[5]。面包果鲜果采收1～3 d内会迅速软化,储存性能差[6],而将面包果加工成淀粉可便于存储和增加通用性。

目前淀粉提取的主要方法有湿磨法、碱法、酶法和超声波法[7]。Estrada-León等[8]采用湿磨法提取象耳豆淀粉但其提取率较低;陈子月等[9]表明与酶法相比,碱法制备大米淀粉的溶解度对温度更敏感,而碱法提取会产生大量碱液造成环境污染;Wang等[10]表明酶法和超声波法相结合能显著提高大米淀粉的提取率,但提取的淀粉易破损,导致淀粉性质发生改变。与其他提取方法相比,酶法提取具有温和、破损率低、污染小、效率高等优点[11]。目前对面包果的研究主要集中在面包果淀粉的加工利用方面[12-13],Nwabueze等[14]采用响应面法优化面包果加工膨化食品的工艺条件;Betiku等[15]通过响应面法优化面包果淀粉水解产物以生产乙醇的工艺参数,而关于面包果淀粉酶法制备工艺的优化尚未见报道。

本课题前期实验发现采用中性蛋白酶法提取面包果淀粉提取率高且破损率低,因此采用单因素实验探究中性蛋白酶法提取面包果淀粉的工艺条件,并通过响应面法优化确定淀粉提取的最佳工艺参数,为建立科学高效的面包果淀粉提取工艺提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

面包果 中国热带农业科学院香料饮料研究所提供;中性蛋白酶Protex-7L(酶活200000 U/g) Novozyme公司;其他试剂 均为国产分析纯。

AL104型电子天平 美国梅特勒-托利多仪器有限公司;HX-PB908多功能料理机 奥克斯集团有限公司;Master-s-plus UVF型全自动超纯水系统 上海和泰;Avanti JXN-26型高速冷冻离心机 贝克曼库尔特商贸有限公司;JDG-0.2真空冷冻干燥机 兰州科技真空冻干技术有限公司;RH-600A高速多功能粉碎机 荣浩五金厂;盛蓝HZ-2010 K多层恒温摇床 常州市三盛仪器制造有限公司;MB45型快速水分测定仪 美国梅特勒-托利多仪器有限公司;NDA701杜马斯定氮仪 意大利VELP;DHG-9625 A电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;DK-98-IIA型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;DLSB-5 L/10低温冷却循环泵 巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 面包果淀粉的提取 新鲜面包果→去皮→切块→清洗→研磨→酶解→过滤→水洗→离心→冻干→成品。

将新鲜的面包果去皮切块之后清洗干净,按一定的料液比例加入蒸馏水,置于多功能料理机中磨浆20 s,将面包果磨浆液与一定量的中性蛋白酶液混合,分装于锥形瓶中,置于设定到一定温度的摇床上进行酶解,反应结束后用100目网筛过滤,滤渣再水洗过滤三次,收集合并滤浆,室温静置2 h,弃去上清液,絮状物经蒸馏水洗涤表面后离心(8000 r/min,15 min),轻轻刮去沉淀物上层淡黄色物质,沉淀物反复水洗离心两次,收集沉淀物在冰箱(-20 ℃)中冷冻12 h,再真空干燥(55 ℃)12 h[16]。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 料液比对面包果淀粉提取率的影响 在酶解温度60 ℃、酶解时间6 h、加酶量0.125%(占原料和水总质量百分比)的条件下,考察料液比(原料质量与蒸馏水体积比)分别为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 g/mL时对面包果淀粉提取率的影响,从而确定最佳的料液比。

1.2.2.2 酶解温度对面包果淀粉提取率的影响 在料液比1∶4 g/mL、酶解时间6 h、加酶量0.125%的条件下,分别取酶解温度40、50、60、70、80 ℃,探究不同酶解温度对面包果淀粉提取率的影响,从而确定最佳的酶解温度。

1.2.2.3 酶解时间对面包果淀粉提取率的影响 在料液比1∶4 g/mL、酶解温度60 ℃、加酶量0.125%的条件下,分别取酶解时间2、4、6、8、10 h,探究不同酶解时间对面包果淀粉提取率的影响,从而确定最佳的酶解时间。

1.2.2.4 加酶量对面包果淀粉提取率的影响 在料液比1∶4 g/mL、酶解温度60 ℃、酶解时间6 h的条件下,考察加酶量分别为0.05%、0.075%、0.1%、0.125%、0.15%、0.175%对面包果淀粉提取率的影响,从而确定最佳的酶添加量。

1.2.3 响应面试验 根据Box-Behnken组合实验设计原理,在单因素实验结果的基础上,选择料液比、酶解温度、酶解时间和加酶量作为研究因素,并以面包果淀粉提取率为响应值,进行四因素三水平的响应面设计与分析,试验因素及水平设计如表1所示。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.4 面包果中淀粉含量的测定 依据GB 5009.9-2016采用第二法测定[17]。鲜面包果中淀粉含量为0.1259 g/g。

1.2.5 面包果淀粉提取率的测定

式中:W1表示每克面包果提取得到的淀粉质量(干基),g;W2表示每克面包果中淀粉含量(干基),g。

1.3 数据处理

采用SPSS 22.0软件对数据进行差异性显著分析,其中P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著;采用Origin 2018软件绘图,数据以“平均值±标准差”显示;采用Design-Expert 8.0软件进行响应面实验设计与分析。所有数据均为三次实验的平均值。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 料液比对面包果淀粉提取率的影响 料液比对面包果淀粉提取率的影响如图1所示。由图1可见,随着料液比中蒸馏水量的增加,面包果淀粉提取率先呈现显著上升趋势(P<0.05),在料液比1∶4时达到最高(62.21%),继续增加水量,提取率则呈下降趋势。料液比为1∶2时,淀粉溶液较黏稠,流动性差,酶与底物蛋白接触不充分,不利于酶促反应的发生,而降低了面包果淀粉分子的释放[18]。随着料液比的增加,有更多的溶剂渗透到物料中,增大了面包果淀粉与水的接触面积,进而中性蛋白酶与底物蛋白充分接触反应,使面包果淀粉分子最大限度游离出来。当料液比大于1∶4时,面包果淀粉提取率下降,可能是由于料液中酶浓度被稀释,酶促反应不彻底[19]。综上所述,选择料液比1∶3、1∶4、1∶5进行响应面优化试验。

图1 料液比对面包果淀粉提取率的影响Fig.1 Effects of solid/liquid ratio on theextraction rate of breadfruit starch注:不同字母表示不同提取条件间差异显著(P<0.05);图2～图4同。

2.1.2 酶解温度对面包果淀粉提取率的影响 不同酶解温度对面包果淀粉提取率的影响见图2。由图2可见,随着酶解温度的升高,面包果淀粉提取率先增加后减小,在酶解温度为60 ℃时,面包果提取率呈现最大值,为61.18%。导致这种趋势的原因主要是在一定的温度范围内,随着温度的升高,活化分子数增加,分子间的碰撞机率增加,从而增强中性蛋白酶酶促反应速率[20]。当酶解温度超过中性蛋白酶的活性承受范围,会引起中性蛋白酶变性甚至失活,结果导致酶促反应的减缓甚至停止,从而降低面包果淀粉的提取率。此外,过高的温度引起淀粉糊化,溶液粘稠度增加而进一步影响蛋白酶作用效果[21]。故选用50、60、70 ℃作为响应面优化试验的水平。

图2 酶解温度对面包果淀粉提取率的影响Fig.2 Effects of enzymolysis temperatureon the extraction rate of breadfruit starch

2.1.3 酶解时间对面包果淀粉提取率的影响 面包果淀粉提取率随酶解时间变化结果如图3所示。由图3可见,酶解时间2～6 h,时间不断延长,面包果淀粉提取率也不断提高至61.32%,6 h时提取效果最佳,6 h后淀粉提取率趋于稳定。随着酶解时间的延长,包裹在淀粉分子外的蛋白质被中性蛋白酶不断水解,面包果淀粉分子不断与蛋白质分离并释放,从而提高面包果淀粉提取率[22]。当达到一定酶解时间后,与中性蛋白酶亲和力强的底物蛋白质基本被酶解,进而被此类底物蛋白包裹的淀粉最大程度被释放,而一部分与中性蛋白酶无作用的底物蛋白依旧与淀粉分子牢牢结合,提取过程中随水分流失,因而提取率趋于平稳[23]。故选取4、6、8 h进行响应面优化试验。

图3 酶解时间对面包果淀粉提取率的影响Fig.3 Effects of enzymolysis timeon the extraction rate of breadfruit starch

图4 加酶量对面包果淀粉提取率的影响Fig.4 Effects of enzyme dosageon the extraction rate of breadfruit starch

2.1.4 加酶量对面包果淀粉提取率的影响 加酶量对面包果淀粉提取率的影响如图4所示。由图4可见,在加酶量0.05%～0.125%范围内,面包果淀粉提取率从58.83%增加至64.94%,然而加酶量在0.125%～0.175%范围内时,提取率则下降至59.57%。故得出加酶量为0.125%时,酶解提取效果最好。由酶促反应动力学可知,加酶量是限制酶促反应速率的主要因素,当反应体系中酶浓度较低时,中性蛋白酶浓度与酶促反应速率呈正比[24]。当酶浓度达到饱和后,面包果淀粉提取率出现下降趋势,这是由于酶发生彼此黏附,导致酶解率降低,提取率下降。故选取加酶量0.1%、0.125%、0.15%进行后续响应面优化实验。

2.2 面包果淀粉提取工艺响应面法优化

2.2.1 模型建立与方差分析 根据表1选定的响应面考察因素和水平,通过Box-Behnken方法设计得到29组试验,具体设计与结果见表2。

表2 Box-Behnken中心组合试验设计及结果Table 2 The design and results ofBox-Behnken cenral composite test

利用Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行分析,得到面包果淀粉提取率与各因素之间的二次多元回归拟合方程为:

Y=69.20+0.99A+2.02B+0.37C+2.18D+0.51AB+0.07AC-1.18AD+0.30BC+1.81BD+0.89CD-5.15A2-5.35B2-5.31C2-7.78D2

由表3可知,料液比、酶解温度和加酶量对面包果淀粉提取率影响均极显著(P<0.01),且各因素对提取率影响程度为:D>B>A>C,即加酶量>酶解温度>料液比>酶解时间。料液比和加酶量、酶解温度和加酶量交互作用的影响极显著(P<0.01),酶解时间和加酶量交互作用的影响显著(P<0.05),料液比和酶解温度、料液比和酶解时间以及酶解温度和酶解时间交互作用对提取率的影响不显著(P<0.05)。对于模型的二次项来说均影响极显著(P<0.01)。

2.2.2 各因素交互作用影响 响应面图可以更加直观形象地反映出各单因素以及各单因素之间交互影响的强弱关系[25]。响应面中,固定某个因素,改变另一个因素引起响应值变化,如果响应面走势较陡,说明该因素对响应值影响显著,反之则不显著[26]。响应面优化模型因素(料液比、酶解温度、酶解时间和加酶量)两两交互作用对面包果淀粉提取率影响的响应面曲面图如图5所示。

由图5a分析可知,料液比和加酶量交互作用对面包果淀粉提取率影响的等高线为椭圆形,说明料液比和加酶量交互作用对面包果淀粉提取率的影响显著。当加酶量不变时,随着料液比的增加,提取率呈现先上升后下降的趋势;当料液比不变时,随着加酶量增加,提取率也呈现先增加后减小的趋势。当料液比为1∶4.1,加酶量为0.13%,提取率达到最大值。图5b、图5c和图5d反映了料液比和酶解温度、料液比和酶解时间以及酶解温度和酶解时间交互作用对提取率的影响,对提取率影响的等高线都近似圆形,说明此因素对结果影响不显著。当固定一个变量,提取率会随另一个变量的增大先上升后下降,但随着因素值的改变,提取率变化不明显。当料液比为1∶4.1,温度为62 ℃,时间为6 h,提取率达到最大值。从图5e可以看出酶解温度和加酶量交互作用对提取率影响的等高线为椭圆形,且由曲面图可以看出,结果随因素改变的变化明显,说明此因素交互作用对结果影响显著,在温度为62 ℃,加酶量为0.13%,提取率最高。图5f为酶解时间和加酶量交互作用对提取率的影响,等高线图为较扁的椭圆形,说明对提取率的影响较为显著,随着因素的增加,提取率先增加,在时间6 h,加酶量0.13%时达到最大值,然后提取率出现下降趋势。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

图5 各因素交互作用对面包果淀粉提取率的影响Fig.5 Effect of interaction between various factors on the extraction rate of breadfruit starch

2.2.3 验证试验 通过Design-Expert 8.0.6 软件分析优化,得出中性蛋白酶法提取面包果淀粉的最佳工艺条件为料液比1∶4.09 g/mL、酶解温度62.22 ℃、酶解时间6.11 h、加酶量0.13%,此条件下面包果淀粉提取率的预测值为69.66%。

为了验证响应面试验优化的可行性,选择优化后的条件进行酶法提取面包果淀粉的验证实验。考虑到操作的可行性,将上述最佳条件调整为料液比1∶4 g/mL、酶解温度62 ℃、酶解时间6 h、加酶量0.13%,在此条件下进行3次重复实验,得到的提取率为69.97%±0.14%,与回归方程理论面包果淀粉提取率69.66%相吻合,说明响应面法优化后得到的最佳工艺参数准确可靠,该回归模型具有较好的预测效果。

3 结论

通过响应面法优化面包果淀粉的中性蛋白酶法提取工艺,以面包果淀粉的提取率为响应值进行响应面分析,得到以下结论:各因素对面包果淀粉提取率的影响程度为:加酶量>酶解温度>料液比>酶解时间。料液比和加酶量、酶解温度和加酶量交互作用的影响极显著(P<0.01),酶解时间和加酶量交互作用的影响显著(P<0.05)。中性蛋白酶法提取面包果淀粉的最佳工艺参数为:料液比1∶4 g/mL、酶解温度62 ℃、酶解时间6 h、加酶量0.13%。在最佳条件下得到的面包果淀粉实际提取率为69.97%,与理论值69.66%相吻合。