紫菟二仙汤对雷公藤多苷致早发性卵巢功能不全大鼠卵巢结构与功能的影响*

顾燕频 王荷丹 刘 玮 吕 雯

浙江省立同德医院 浙江 杭州 310012

早发性卵巢功能不全(POI)：指女性在40岁之前以停经或月经稀发4个月伴有高促性腺激素和低雌激素为特征，间隔＞4周连续两次FSH＞25U／L为诊断标准的卵巢活动衰退的临床综合征[1]。POI影响女性的生殖与心理健康，如果能做到早诊断、早发现、早治疗，具有重要的临床意义。近年来，临床发现抗苗勒管激素（AMH）及血清抑制素B（INH-B）为卵巢储备功能评估提供重要的参考价值[2-4]。紫菟二仙汤为我科临床验方，具有改善患者临床症状，降低患者Kupperman评分，显著降低FSH(P＜0.05)，提高卵巢功能的作用[5]。本研究采用雷公藤多苷建立药物性所致POI大鼠模型，动态观察紫菟二仙汤不同剂量对大鼠卵巢的组织病理学和AMH、INH-B等内分泌指标的影响，为深入研究中医药防治POI提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物：10周龄健康雌性SD大鼠，体质量200g左右，购自浙江医学科学院实验动物中心(许可证号：SCXK浙2019-0002)。饲养于浙江省医学科学院SPF级动物实验室。大鼠入室后适应1周，连续5～7d行阴道涂片判断动情周期，选取有规律动情周期的120只大鼠作为实验动物。

1.2 实验药物及试剂：雷公藤多苷片购于上海复旦复华，补佳乐购于拜耳，达芙通购于雅培，紫菟二仙汤（紫河车3g，菟丝子15g，仙茅、仙灵脾、当归、知母、炒黄柏各12g，郁金6g）购于江阴天江药业有限公司。ELISA试剂盒购于美国OminmAbs公司。

1.3 模型制备与分组：随机选取100只大鼠应用雷公藤多苷片50mg/kg灌胃法制作POI动物模型，连续给药14天。药后随机分为模型组（M组）、西药组（X组）、紫菟二仙汤低剂量（L组）、中剂量（Z组）和高剂量（H组）5组。各药物组剂量按大鼠与人体表面积转换系数计算。西药组予补佳乐0.1mg/kg+达芙通1.8mg/kg溶于生理盐水灌胃。中剂量组为紫菟二仙汤人体常规服用剂量转换，低剂量组为中剂量组一半量，高剂量组以2倍中剂量给药。20只大鼠作为空白对照组（N组），M组及N组以等体积生理盐水灌胃。给药3周及9周后分别采集各组数据。

1.4 一般情况观察：每天下午13时观察生命体征、进食、排便、行为变化和毛色变化等。

1.5 血清中FSH、E2、AMH及INH-B含量测定：各组大鼠分别给药3w、9w后，每组大鼠随机取10只。称取大鼠体质量，10%水合氯醛以3ml/kg剂量麻醉大鼠。麻醉后开腹，腹主动脉取血，静置4h后，3000r/min离心15min，分离血清，液氮冻存，-80℃储存。ELISA法按照FSH、E2、AMH及INH-B试剂盒说明书操作，并保证标准曲线R2＞0.99。

1.6 卵巢及子宫组织光镜观察：各组取2只大鼠用于形态学实验。取血后摘取大鼠双侧卵巢、子宫，加入4%多聚甲醛溶液中固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片，脱蜡，常规 HE染色，做病理切片。置光学显微镜下观察各组大鼠卵巢及子宫的形态变化。

1.7 统计学方法：采用SPSS 23.0统计分析软件，呈正态分布的计量资料均用±s表示。多组间比较采用单因素方差分析进行LSD检验，两组间比较采取独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况比较：用药3w后，各组大鼠进食、排便、行为变化和毛色变化未见明显变化。用药9w后，与N组相比，M组进食、排便、行为变化和毛色变化未见明显变化。与M组相比，中药组大鼠进食较多，毛色光亮。

2.2 各组大鼠卵巢组织形态学观察：N组：3w及9w卵巢皮髓质结构清晰，可见各期卵泡，形态结构正常。间质未见明显炎细胞浸润及纤维化。M组：3w的卵巢结构紊乱，各级卵泡较正常少，外形扭曲，卵泡颗粒细胞层较正常减少，排列紊乱，可见较多的间质、纤维血管等。9w的卵巢各级卵泡较正常明显减少，发育成熟的卵泡更少，卵巢组织结构排列紊乱，卵巢间质可见较多淋巴细胞及浆细胞，浸润。X组：3w及9w各级卵泡可见，发育成熟卵泡较多。卵泡颗粒细胞层较M组增多，排列较紧致，卵泡液丰富。L组：3w及9w可见各级卵泡较正常减少，有卵泡破碎产生颗粒细胞小巢或条索，卵巢组织结构排列紊乱，卵巢间质可见淋巴细胞及浆细胞浸润。Z组：3w的卵巢可见各级卵泡，但卵巢结构紊乱，卵泡发育较M组成熟，卵泡颗粒细胞层较M组增多。9w可见各级卵泡，卵巢结构较正常，卵泡形态较规则，卵泡液丰富。H组：3w及9w皆可见各级卵泡，发育成熟卵泡较多，卵泡颗粒细胞层较M组增多。

2.3 各组大鼠子宫组织形态学观察：除3w及9w的M组子宫内膜不连续，其余各组大鼠子宫内膜完整，组织排列整齐，未见明显异常。

2.4 各组大鼠血清FSH及E2含量比较：3w：与N组相比，M组的FSH含量显著升高，E2明显降低（P＜0.05）；与M组相比，X组、Z组及H组FSH明显下降，E2升高（P＜0.05）。与H组相比，L组血清FSH升高、E2含量降低（P＜0.05），Z组血清FSH表达有所升高（P＜0.05）。9W：与N组相比，M组的FSH含量进一步升高，E2显著降低（P＜0.05）；与M组相比，X组、紫菟二仙汤3组FSH含量下降，E2含量升高（P＜0.05）。与H组相比，L组血清FSH升高、E2含量降低（P＜0.05），Z组血清FSH表达有所升高（P＜0.05）。紫菟二仙汤L、Z及H组在降低血清FSH、提高E2含量上成正比。与3w相比，9w的M组FSH含量有所升高，E2进一步降低（P＜0.05）；其余各组组间比较不具有统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠FSH及E2比较（±s）

表1 各组大鼠FSH及E2比较（±s）

注：与N组比较，*P＜0.05；与M组比较，#P＜0.05；与3w比较，△P＜0.05；与H组比较，&P＜0.05。

组别9w 88.73±11.45#52.49± 8.66*△&78.70±4.57*#63.76±5.38*#&76.07±9.17*#80.64±6.39*#例数FSH（IU/L）N组M组X组L组Z组H组10 10 10 10 10 10 3w 2.35±0.19#3.37±0.40*&2.60±0.32#3.44±0.63*&3.07±0.54*#&2.57±0.43#9w 2.57±0.11#4.47±0.43*△&2.81±0.34#3.90±0.37*#&3.21±0.57*#&2.78±0.34#E2（pg/ml）3w 92.09±11.91#&63.13±6.03*&83.89±8.07*#67.54±11.86*72.22±9.57*#79.53±6.23*#

表2 各组大鼠AMH及INH-B比较（±s）

表2 各组大鼠AMH及INH-B比较（±s）

注：与N组比较，*P＜0.05；与M组比较，#P＜0.05；与3w相比，△P＜0.05；与H组比较，&P＜0.05。

组别9w 12.57±1.19#&6.20±1.99*△&9.59±1.79*#8.43±1.37*#9.50±1.60*#9.56±1.16*#例数N组M组X组L组Z组H组10 10 10 10 10 10 AMH（pg/ml）3w 1245.72±111.50#&960.20±68.40*&1123.05±96.83*#989.63±54.41*&1101.89±121.96*#1119.23±136.8*#9w 1292.01±85.33#862.15±74.81*△&1174.62±133.86*#1024.30±122.36*#&1135.79±160.66*#1181..20±169.19*#INH-B（pg/ml）3w 11.73±1.49#&7.75±1.56*&9.34±1.80*#8.11±0.84*&8.71±1.06*9.72±1.56*#

2.5 各组大鼠血清AMH及INH-B含量比较：3w：与N组相比，M组的AMH及INH-B含量显著下降（P＜0.05）；与M组相比，X组、Z组及H组AMH升高（P＜0.05），X组及H组INH-B含量提高（P＜0.05）。与H组相比，L组AMH及INH-B含量降低（P＜0.05）。9w：与N组相比，M组AMH及INH-B含量进一步降低（P＜0.05）；与M组相比，X组、紫菟二仙汤3组AMH及INH-B含量升高明显（P＜0.05）。与H组相比，L组血清AMH含量降低（P＜0.05）。L组、Z组及H组在提高血清AMH及INH-B含量上成正比。与3w相比，9w的M组AMH及INH-B含量进一步降低（P＜0.05）；其余各组组间比较不具有统计学意义（P＞0.05）。见表2。

3 讨论

40岁以下女性出现月经紊乱伴或不伴有潮热、盗汗、失眠、易怒等不同的临床症状，是卵巢功能减退的表现。此过程是一个动态的过程，其终末状态为卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）。明确POF的诊断对患者会产生巨大的心理冲击，对其生育能力的保存提出了巨大的挑战[6]。POI概念的提出让我们更早一步认识到本病的危害性，POI的预防和早期治疗比POF形成后的治疗可能更有意义[7-8]。

目前AMH联合INH-B评估卵巢储备功能在临床工作中的价值日益加重[2-4]。本研究结果显示：与N组相比，M组血清AMH、INH-B及E2水平显著下降，FSH水平显著升高（P＜0.05）。且M组大鼠血清AMH及INH-B水平随饲养时间的延长进一步下降，一方面说明药物作用下卵巢功能损伤与时间因素具有密切联系，另一方面说明AMH联合INH-B在动物实验研究上亦是敏感的参考值。在组织形态学上，M组卵巢组织显示卵巢成熟卵泡少，卵泡颗粒细胞层较正常减少，排列紊乱，卵巢间质可见淋巴细胞及浆细胞浸润，但子宫组织未见明显变化，结合卵巢功能指标，说明POI大鼠模型制作成功。

POI依据其临床表现，可归属于中医学“闭经”“不孕”“经水早断”“血枯”“妇人脏躁”等范畴。《黄帝内经》曰：“五七，阳明脉衰，面始焦，发始堕。六七，三阳脉衰于上，面皆焦，发始白。七七，任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也。”这一过程说明女性生殖功能与年龄有着密切的关系。肾藏精，主生殖，肝藏血，主疏泄，肾虚肝郁是本病根本病机。二仙汤具有补肾阳、滋肾阴、调和阴阳之功效，我科在此方基础上加入血肉有情之品紫河车、补肝益肾的菟丝子、清心解郁化瘀的郁金组成了紫菟二仙汤，通过在长期临床工作验证其具有改善患者临床症状，提高卵巢功能的作用[5]。现代药理学研究发现紫河车中具有改善子宫内膜容受性，提高超排卵大鼠妊娠率的作用[9]。菟丝子醇提取物可提高肾阳虚证大鼠血清IgM和IgG水平，调节其免疫功能的作用[10]。本研究动态观察发现：中、高剂量组的紫菟二仙汤可不同程度改善POI大鼠的卵巢结构，且具有提高AMH、INH-B及 E2含量，降低FSH含量（P＜0.05）。说明紫菟二仙汤具有改善卵巢结构，提高卵巢功能的作用。

综上所述，紫菟二仙汤具有改善卵巢结构，并通过提高血清AMH、INH-B等敏感指标说明其改善卵巢功能的作用。如能进一步研究明确其改善POI作用机制，则将更有利于充分发挥中医药治疗POI的优势和特色。