基于16SrRNA基因测序技术分析痰证糖耐量减低患者的肠道菌群特点*

杜含光 陈霞波 顾颖杰 周 开 张 业 谢莉莎

1 宁波市中医院 浙江 宁波 315010

2 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

糖耐量异常(impaired glucose tolerance，IGT)主要表现为糖耐量减低，此类患者发生糖尿病的风险显著高于正常人，饮食运动干预虽经济、安全，但临床不少患者依从性差，肠道菌群调节剂逐渐成为防治IGT的新靶点[1-2]。16SrRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中。本研究拟通过16SrRNA基因测序技术检测痰证IGT患者与健康人群的肠道菌群，分析肠道菌群基因组成结构及多样性的差异，探讨肠道菌群与IGT痰证的相关性及规律，旨在通过保持肠道的菌群平衡来预防IGT的发病，为中医药证候研究提供新的研究思路和方法。

1 资料与方法

1.1 研究对象：40例患者均来自宁波市中医院的IGT患者，经院伦理委员会批准且自愿签署知情同意书。其中男22例，女18例，年龄28～70岁，平均45.16±6.23岁。

1.2 IGT诊断标准：空腹血糖＜7.0mmol/L；葡萄糖耐量试验(OGTT)即口服75g葡萄糖2h后血糖7.8～11.1mmol/L。（以上为静脉血浆测值）

1.3 证素辨证：具体方法参照朱文锋《证素辨证学》。以“常见症状的辨证意义”为依据，制定全面、规范化采集表进行证素评分，确定证素是否存在及轻重程度。如积分＜70分，归为0级，说明基本无病理变化；70分≤积分＜100分，归为1级，说明该证素存在轻度病变；100分≤积分＜150分归为2级，说明存在中度病变；积分≥150分，归为3级，说明存在重度病变。临床出现的兼夹证分别计入与之相应的证素。

1.4 纳入标准：①符合以上诊断标准者；②患者依从性好，配合调查。

1.5 排除标准：①年龄＜30岁或＞70岁；②Ⅰ型、2型糖尿病和妊娠糖尿病者、继发性高血压、继发性高脂血症者；③有严重的心、肝、肾等并发症；④精神病者；⑤孕妇及哺乳期妇女⑥半年前有使用抗生素史。

1.6 健康对照人群：在健康体检人群中筛选。剔除标准：有糖尿病、高血压、高血脂、冠心病、脑血管病、恶性肿瘤及慢性感染病史；有明显的血糖、血脂、血常规及肝肾功能异常者。

1.7 四诊资料采集：根据《中华人民共和国国家标准·中医临床诊疗术语》，制定规范量表，做到四诊资料规范化。由2名（内分泌科主治或主治以上的医师）经过严格培训且合格中医专业人员按规范的方法收集四诊资料。

1.8 证的要素提取：本研究中气虚痰浊证组是指痰和气虚的病理积分同时≥100分者；而非气虚痰浊证组是指患者可能存在一定程度的痰的病理变化，但尚未构成真正意义的痰证，具体地说，即痰和气虚的病理积分＜100分者。每一症状的轻重，以中等程度为准，若该症状重时，其定量诊断值乘1.5，若该症状轻时，乘0.7。

1.9 粪便样本DNA抽提和检测：样本中微生物DNA的提取采用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒（QIAGEN，Hilden，Germany）。提取方法按照试剂盒说明书进行。利用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA的完整性。

1.10 细菌16SrDNA序列扩增和MiSeq测序：选取16S rDNA的 V4-V5区序列进行高通量测序分析。采用两步PCR扩增方法进行文库构建。将纯化的DNA作为模板，利用 16SrDNA V4-V5区通用引物 515F(5’-GTGCCAGC‐MGCCGCGG-3’)和926R（5’-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3’）PCR扩增目的片段16S rDNA V4-V5区。

1.11 统计学分析：所有数据均用SPSS 22.0软件进行统计分析。使用t检验对不同分组间基本资料进行差异分析。分类学分析采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析。检测组间物种显著丰度差异采用Kruskal-wilcox非参数检验。计量资料采用t检验，数据以平均值±标准差（±s）表示，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 菌群物种注释分析：在97%相似水平下对OTU进行标准聚类，得到579个OTU，根据序列绘制聚类韦恩图，其中痰证组（A1）与健康组（C）标本包含的数目分别为570、385个，2种标本共有的OTU数目为376个（图1）。

图1 OTU韦恩图

2.2 菌群结构组成分析：对两组研究对象样本进行菌群结构组成分析，图2为两组标本分别在门、纲、目、科、属、种分类等级的物种相对丰度柱状图。图3为群落在各分类水平上的Heatmap图。门水平上IGT痰证患者（A1）与健康人（C）肠道中菌群优势物种极其相似，痰证组与健康组的优势菌群中软壁菌门的相对丰度差异较大，痰证组软壁菌门的相对丰度显著高于健康组（见图3A）。纲水平上以拟杆菌纲、梭菌纲、γ-变形菌纲、Nneg‐ativicute为优势菌群；痰证组（A1）与健康组（C）肠道中优势菌所占比例不同（图2B）：痰证组与健康组中梭菌纲、杆状菌纲、α-变形菌纲、梭杆菌纲的相对丰度差异明显，痰证组杆状菌纲、α-变形菌纲、梭杆菌纲的相对丰度高于健康组（见图3B）。图2C为两组标本分别在目分类等级的物种相对丰度柱状图，痰证组与健康组中梭菌目、乳杆菌目、梭杆菌目的相对丰度差异较大，痰证组中梭菌目的相对丰度明显低于健康人，乳杆菌目、梭杆菌目的相对丰度明显较健康人高（图3C）。科水平上痰证组（A1）与健康组（C）的优势菌群存在差异，图2D为两组标本分别在科分类等级的物种相对丰度柱状图。痰证组与健康组中乳杆菌科、普雷沃氏菌科、梭杆菌科的相对丰度差异较大，均高于健康组（图3D）。图2E为两组标本分别在属分类等级的物种相对丰度柱状图，其中乳杆菌属、普雷沃氏菌属、梭杆菌属、肠球菌属的相对丰度痰证组较健康组高，双歧杆菌属、瘤胃球菌属、罕见小球菌属痰证组较健康组低（图3E）

图2 IGT痰证组与健康组菌群在各分类水平上的丰度柱状图

2.3 菌群物种差异分析：为检测两组微生物群落在各个分类水平中表现出的丰度差异，并用柱形图展示出来（图3）。在属水平上，痰证组普雷沃氏菌、梭杆菌的丰度显著高于健康组，罕见小球菌属、劳特氏菌属、副萨特氏等属的丰度显著低于健康组（图3E）；种水平上，痰证组普雷沃氏菌、乳杆菌、加德纳菌、韦荣氏球菌丰度显著高于健康组（图3F）。

图3 IGT痰证组与健康组菌群在各分类水平上 Heatmap的图

2.4 群落多样性分析：以shannon指数来评价肠道微生物的多样性，shannon指数越大表明群落多样性越强，将两组样本的shannon指数通过秩和检验得出两组样本的shannon指数的P值为0.043，其差异具有统计学意义（P＜0.05）（图4），IGT痰证患者肠道菌群群落的多样性显著低于健康人。

图4 痰证组与健康组shannon指数线箱图

3 讨论

在IGT发病过程中，胰岛素抵抗（insulin resis‐tance，IR）被认为是始动和中心环节。越来越多的证据显示，肠道微生态的改变在IGT和2型糖尿病发病中起着重要作用。[3-5]本研究通过高通量测序技术对样本肠道菌群的16S rRNA V4-V5区进行测序分析，两组人群的肠道菌群的组成结构差别主要体现在某些具体种类的菌群其数量占比的改变以及相对丰度的改变。本研究中观察组的普氏菌相对丰度明显要高于对照组，Ruminococ‐caceae（瘤胃菌）的相对丰度较正常组显著下降，既往研究发现普氏菌与肠道的通透性相关，具有抵御病原菌防止炎症的发生和调节血糖的重要作用[6-7]。国外最新一项研究探讨了肠道菌群代谢组与胰岛素抗性之间的关系，发现在胰岛素抗性个体中脂多糖和支链氨基酸(BCAA)生物合成的潜力增大。这表明，由肠道菌群失调的血清代谢组变化有可能导致糖尿病的发生发展。普氏菌和普通拟杆菌参与经证实肠道细菌生物合成BCAA，为了在机制上测试肠道细菌是否真的导致胰岛素耐受性，研究人员小鼠喂食人体普氏菌。喂食人体普氏菌的小鼠血中BCAA明显升高，而且产生胰岛素耐受性和葡萄糖不耐受性。研究人员还发现，瘤胃菌科的微生物家族与血管硬化关系密切，瘤胃菌的多样性低，血管硬度水平高[8]。

综上，我们认为痰证是导致代谢综合征、IGT等多种代谢疾病的一种病理因素，此次研究我们初步推测，痰证IGT患者普氏菌丰度的增加以及瘤胃菌科丰度值下降，可能是导致IGT痰证的潜在因素。补充和调节瘤胃菌、普氏菌的丰度值可能是靶向治疗和预防IGT痰证患者的有效途径之一，但由于本文中16SrRNA基因测序技术的局限性以及纳入的研究对象数量有限，后续研究可考虑应用宏基因组测序技术并增大研究样本量，找出差异基因，以进一步探讨普氏菌和瘤胃菌科相互作用于IGT的内在机制。