微丝在黏菌显型原质团中的分布

常雨婷，任棋圆，李艳双，王晓丽,，李 玉

(1.吉林农业大学 农学院，吉林 长春 130118; 2.吉林农业大学 食药用菌教育部工程研究中心，吉林 长春 130118)

黏菌在世界范围内数量较少，且个体微小不易观察，一般多在腐烂潮湿的环境中生活，可生活在多种基质上,包括腐木、落叶、土壤等,在生活史的不同阶段分别具有类似真菌和动物的特征[1-2]，是一类不为人知的生物。黏菌的生活循环中，应该具有以下4个典型的阶段：原质团、黏变形体、游动胞以及孢囊[3-5]。黏菌的生活周期有2个阶段，分别是营养生长阶段和繁殖阶段。原质团处于营养生长阶段，是非细胞结构，不具有细胞壁，当游动胞和黏变形体的数量达到临界值时，性亲和细胞相互接触形成二倍体接合子[6-7]，接合子进行连续的有丝分裂但不进行胞质分裂而转变成多核变形体结构，从而形成一层纤薄的原生质膜和一个胶质鞘包围的一团原生质。黏菌在分类学上属于低等真核生物，也称非细胞黏菌。现已证明在黏菌原质团的细胞核骨架上存在有肌动蛋白，而且原质团中也存在大量肌动蛋白，原质团中团集的网体被认为是原质团的骨架成分[8-10]，原质团中存在的肌动蛋白是否参与形成骨架结构尚无定论[11]。

原质团主要可以分为3种类型，显型原质团(Phaneroplasmodium)、隐型原质团(Aphanoplasmodium)和原始型原质团(Protoplasmodium)[12]。其中，显型原质团，一般形状明显，体积较大，整体呈现微小颗粒状结构，是半流体状态，具有胶黏性，伸展面的前端多呈现出扇形，边缘清晰可见，后端多为网脉状结构，是一团具有摄食特性、多核、非细胞结构的原生质，具有极性，其内部具有节律性的往返原生质流[13]。原生质流的流向总体方向是扇面端，引起反向原生质流的原因是原质团中凝胶物质的堵塞和扇面端的尚未分化，也正是反向原生质流形成了前缘的扇面，越是在原质团的后部，反向流动的原生质流越少。

微丝是由球形肌动蛋白单体形成的多聚体,在多数真核细胞中，是含量最丰富的蛋白质之一，它参与了细胞微环境调节、变形运动、胞质分裂、肌肉收缩、信号传递吞噬作用以及细胞迁移等许多重要的生物功能[14-15]。有关研究表明，肌动蛋白会影响双孢蘑菇的基质降解能力[16]。在真核细胞进化过程中，肌动蛋白保持着高度保守，肌动蛋白的分子裂缝使得蛋白分子在结构上存在着不对称性，微丝表面与微丝结合蛋白相互作用，形成了微丝的不同结构，并表现出功能差异。肌动蛋白基因作为可用于植物界、动物界和真菌界分子系统学研究的一个重要基因，也被证明可用于真黏菌的系统发育研究[17]。

在原质团中肌动蛋白的存在方式一直以来都存在着盲区，原质团中有节律性的原生质流是否是胞质环流的另一种存在方式[18]，微丝是否参与了原生质中细胞质的运动，是值得深入探究的问题。鉴于此，研究微丝在黏菌显型原质团中的分布状态及其生物学方式，以期实现从细胞核层面研究显型原质团的目的，为今后进一步研究黏菌的内部结构提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试材料煤绒菌(Fuligoseptica)孢子由吉林农业大学黏菌标本馆提供，在吉林农业大学农学院遗传实验室条件下诱导萌发煤绒菌孢子，获得煤绒菌显型原质团。

1.2 试验方法

已获得的煤绒菌显型原质团，在水琼脂培养基上每天饲喂燕麦粉和无菌水。在moticSMA 168体视显微镜下，观察煤绒菌显型原质团的迁移。制备煤绒菌显型原质团冰冻切片。细胞骨架绿色荧光探针ActinRed贮存含量200 U/mL,工作含量0.5 U/mL。煤绒菌原质团冰冻切片，PBS洗涤2次，3.7%甲醛固定，室温10 min，PBS洗涤2次，用含有0.1% TritonX-100的PBS洗涤3～5 min,PBS洗涤2次，用含有5%甲醇的PBS预染，含0.5 U/mL的5%甲醇染色20 min,PBS洗涤2次，室温干燥，镜检。利用Adobe Photoshop CC 2017及 Auto CAD 2018 软件进行系统建模。

2 结果与分析

2.1 煤绒菌显型原质团培养过程

图1是在实验室条件下，煤绒菌孢子萌发获得煤绒菌显型原质团的全过程。将野外采集的培养基物、松枝和树皮等浸泡于无菌水12 h后，过滤煮沸后进行高温灭菌，获得喷施用营养液。将营养液冷却至常温，对煤绒菌孢子进行萌发培养。图1A为煤绒菌子实体，图1B为子实体结构放大图像，图1C为显微镜下分散的孢子，图1D中孢子开裂吐出黏变形体，图1E为孢子产生游动细胞。黏变形体和游动细胞在条件适宜时形成初期显型原质团，如图1F所示。对已获得的显型原质团进行水琼脂培养，每天饲喂燕麦粉及无菌水，图1G为中期显型原质团，图1H为后期显型原质团，图1I为末期显型原质团，用于后续试验。

A：煤绒菌子实体；B：子实体结构放大图像；C：分散的孢子；D：孢子开裂吐出黏变形体；E：孢子产生游动细胞；F：初期显型原质团；G：中期显型原质团；H：后期显型原质团；I：末期显型原质团A:Fruiting body of Fuligo septica;B:Structural enlargement of fruiting body;C:Scattered spores;D:Spores spit out myxamoebae;E:Spores produced swarm cell;F:Initial stage of phaneroplasmodium;G:Mid-term stage of phaneroplasmodium;H:Late stage of phaneroplasmodium;I:Terminal stage of phaneroplasmodium

2.2 煤绒菌显型原质团迁移连续过程

图2显示的是煤绒菌显型原质团菌脉前缘扇面端的一部分，在散射光、室温22 ℃、时间间隔为30 min的条件下，呈现的是煤绒菌显型原质团迁移的连续过程。其中，颜色较暗的部分为煤绒菌显型原质团。煤绒菌显型原质团迁移过后，水琼脂培养基向下出现凹陷，痕迹明显，形态与煤绒菌显型原质团存在时相同，有着较清晰的脉络网纹。白色圆圈为标志区域，当培养基养分匮乏时，煤绒菌显型原质团从圈中所示部位逐渐迁出，流向其他扇面端，完成全程迁徙过程仅需要1.5 h。

蓝色圆圈标志区域在观察过程中出现2次迁移，耗时5 h完成，具体表现为图2A—B为迁移准备阶段，无明显变化；图2C出现第1次明显迁移，并看到发生迁移位置的原质团脉络；图2D时原质团脉络迁移，可观察到培养基表面凹陷；图2E—G迁移过程中止，无明显变化；图2H—I时原质团出现第2次迁移，并有脉络出现；图2J—L迁移过程结束，无明显变化。图2A中原质团最内侧脉络于2 h后完全消失，表明原质团迁移是一个动态过程。

A—B：迁移准备阶段；C：第1次迁移过程，可见原质团脉络；D：原质团脉络迁移,培养基表面凹陷；E—G：迁移过程中止；H—I：第2次迁移过程，有脉络出现；J—L：迁移过程结束A—B:Migration preparation phase;C:First migration process,phaneroplasmodium context was visible;D:The phaneroplasmodium context migrated,and the surface of the medium was sunken;E—G:Migration process suspended;H—I:Second migration process,context appeared;J—L:The migration process ended

根据Adobe Photoshop CC 2017及 Auto CAD 2018 软件进行系统建模的结果，对图2中的白色和蓝色标志阴影部分进行面积计算。如表1所示，原质团的迁徙过程中会出现回缩现象，流动状态具有节律性，在到达扇面前端后，会向着相反的方向流动。

表1 黏菌煤绒菌显型原质团标志阴影部分面积变化Tab.1 The shaded area change of markings of phaneroplasmodium of Fuligo septica

2.3 煤绒菌显型原质团微丝分布状态

图3是煤绒菌显型原质团冰冻切片后，原质团中微丝被荧光染色后的存在状态。图3A—B是没有经过TritonX-100处理的原质团微丝结构，其中微丝呈现交叉的网状，微丝可能是原质团中团集的网体的组成成分。图3C—E是经过TritonX-100处理的原质团微丝结构，微丝呈现明显的亮绿色。图3D—F分别是图3C—E的区域放大图像，在图3C—E中，团集的网体明显消失，在菌脉中，近似内质和外质的交界处出现了连续排列的微丝束。

A—B:未经过TritonX-100处理的原质团微丝结构;C—E:经过TritonX-100处理的原质团微丝结构;D—F:C、E的区域放大图像A—B:Phaneroplasmodium microfilament structure without TritonX-100 treatment;C—E:Phaneroplasmodium microfilament structure with TritonX-100 treatment;D—F:The enlarged image of the area in Fig.C and E

3 结论与讨论

在植物细胞中，细胞质的流动是围绕中央液泡进行的环形模式，细胞周质区的细胞质是相当稳定、不流动的，只是靠内层部分的胞质溶胶在流动，在能流动的不流动细胞质层面有大量微丝平行排列，会同叶绿体通过细胞膜蛋白和细胞骨架系统的连接锚定在一起，增强了细胞承受机械力的能力。胞质环流是由肌动蛋白和肌球蛋白相互作用，通过水解、分解反应将生物化学能转化为动能引起的。微丝具有极性，在生物体中，由肌动蛋白单体组装成为微丝的过程中，发生成核反应，当肌动蛋白单体到达临界浓度时，微丝会进行自发组装。在植物细胞中，肌动蛋白的排列方向是相同的，正向朝向流动的方向，这决定了原生质的运动方向。在动物细胞中，如果蝇卵母细胞中,细胞周质区的细胞质稳定不流动,周质区以外的细胞质处于流动状态，微丝平行排列于流动与不流动的细胞质交界层面。

在分类学上，黏菌属于低等真核生物，和其他真核生物具有相同的生物学现象[19-20]。原质团表面胶黏质的鞘中含有微纤丝，与微丝是否为同一物质，尚有待进一步研究。显型原质团中团集的网体的成分之一应该是微丝，可能与微管蛋白共同作用完成一系列的生物学行为。TritonX-100是非离子去垢剂，可以消解部分蛋白质，利用TritonX-100作用于显型原质团表面的胶黏质鞘后，交织的微丝消失，可能是肌动蛋白单体低于临界浓度，微管蛋白发生解聚现象。

通过对全白绒泡菌的研究表明[21]，对于一个宽度在200 μm左右的菌脉来说，两侧的凝胶外质各占三分之一，中间大约有三分之一为溶胶内质。通过TritonX-100处理后微丝存在的位置，大约介于凝胶和溶胶的交界处。细胞骨架绿色荧光探针ActinRed是荧光染料四甲基罗丹明(TRITC)标记的鬼笔环肽(Rhodamine-Phalloidin)，与微丝有强烈的亲和作用。微丝是肌动蛋白的多聚体，虽然对微丝的结构尚有争议[22]，但直径大约都在7 nm，在普通的光学显微镜下难以观察。本研究对煤绒菌显型原质团进行冰冻切片后，观察到大量平行排列的微丝束。原质团中微丝被荧光染色后的存在状态，呈现出明显交叉网状，所以微丝可能是原质团中团集网体的组成成分。

本研究通过培养煤绒菌孢子得到显型原质团，对显型原质团进行连续培养，得到了煤绒菌显型原质团的迁移特点。对显型原质团进行荧光染色冰冻切片，发现在煤绒菌显型原质团中存在着微丝结构，在显型原质团中观察到大量平行排列的微丝束，并进一步得出，微丝存在的位置在菌脉的凝胶外质和溶胶内质的交界处，呈现出明显交叉网状。微丝在显型原质团的分布状态，为黏菌原质团肌动蛋白参与了原生质流的运动提供了有力细胞学证据，判断出微丝可能是原质团中团集网体的组成成分。