琼脂糖凝胶电泳法测定小麦中长穗偃麦草的基因

单张凡

（江西农业大学农学院，江西南昌 330045）

长穗偃麦草是小麦远缘杂交利用最广泛和成功的小麦近缘物种之一，在小麦育种和生产中作出重大贡献［1］二倍体长穗偃麦草具有抗炎、抗旱等优秀性状，因而人们较早地开展了小麦与长穗偃麦草的远缘杂交和回交转育工作，相继育成了一套完整的小麦-长穗偃麦草二体附加系和代换系［2］，本试验通过DNA提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳法等方法，对长穗偃麦草杂交的几个组合小麦进行了检测，检测其抗白粉病基因，并验证了方法的准确度和重现性，以期后续相关研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料本试验所采用的实验材料均由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供，具体组合为新春37∕XC（长穗偃麦草杂交后代）10、新春37∕XC31、新春37∕XC35

1.2 试验步骤

1.2.1 播种 组合新春37∕XC10取63粒种子、新春37∕XC31取15粒、新春37∕XC35取22粒播种，取5×10的培养盘2盒，在培养盘中放入由农场土、肥料土和较为松软的营养土混合而成的土，拨平土面，将种子从格子中间压入土中。然后将其转移至温室，定期浇水。

1.2.2 DNA检测溶液的配制 取样：在小麦1叶1心期进行取样。取2g左右小麦的叶片，放入2mL的离心管中，将离心管放入液氮罐中防止叶片失活。

磨样：将装有小麦样品的离心管从液氮罐中捞出来并迅速放入磨样机粉碎。

DNA提取：将已经研磨至粉末状的样品捞出，加入0.8mL裂解液（1%SLS裂解液），剧烈振荡，充分混匀，于室温 静 置10min；加 入0.8mL 的CTAB 提 取 液，室 温 静 置10min，12000rpm离心10min后，将上清液移至1.5mL离心管中，重复此操作1次；加入上清液0.6倍体积的预冷异丙醇，充分混匀，-20℃沉淀30min；4℃10000rpm离心10min，弃上清，加入1mL75%乙醇洗涤沉淀2 遍，每次4℃10000rpm离心5min后弃上清，第3遍用无水乙醇洗涤，离心后弃上清，在超净工作台吹干；向干燥的DNA中加入TE缓冲液，溶解DNA.得DNA提取液

DNA提取液浓度检测：使用NanoDrop1000微量紫外-分光光度计测定样品液的纯度及质量浓度。打开Nano⁃Drop软件，设计Type为DNA，加入1µL DNA提取液进行测定，得出DNA浓度、260∕280、260∕230数值。DNA浓度范围应为100ng∕ul左右，若过大，则应加入TE缓冲液进行稀释；260∕280数值应在1.9左右；260∕230数值不得小于2.0。

1.2.3 PCR扩增 PCR体系的构建：在离心管中分别加入154.8µL Mix、3.6µL ThpF、3.6µL ThpR，混合离心，在96孔板中先加入1.5µL 检测后的DNA，取13.5ul离心后的溶液，封口，放入PCR仪中。

PCR扩增反应程序：94℃预变性2min；94℃变性20s；根据不同的引物设置不同的退火温度，退火15s；60℃延伸30s；最后72℃延伸7min的扩增后的溶液。

1.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测 凝胶的配制：称取2.5g琼脂糖粉置于250mL的锥形瓶中，加入100mL TAE溶液，将锥形瓶置于微波炉中中火加热，摇晃后再次置于微波炉中加热进行消泡后，加入5µ LEB染液混合均匀，倒入实现准备好的胶盒中，并放好梳子，静置10min后小心地垂直拔出梳子。

琼脂糖凝胶电泳检测：取出已成的胶体，放于电泳槽中，将经PCR扩增后的DNA溶液小心加入点样孔，盖上盖子，然后启动电泳仪，在140V的电压下等待20min后取出胶体，放在凝胶成像分析系统中进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 3种组合的检测结果利用引物Thp51、Thp43、Thp7、Thp34分别构建不同的PCR体系，并利用琼脂糖凝胶电泳法对新春37∕XC10、新春37∕XC31、新春37∕XC35进行检测。不同引物和退火温度对3种组合的检测结果见图1～4。由图1～4可见：不管是哪一种PCR体系，这几个组合的扩增结果并没有发生改变，均只有新春37∕XC31、新春37∕XC35的部分幼苗跑出了与长穗偃麦草相同的亮带，说明这些拥有与长穗偃麦草相同亮带的品种中导入了长穗偃麦草的基因，且此方法准确度较高。

2.2 方法重现性的验证采用引物Thp51，退火温度58.4对新春37∕XC31和新春37∕XC35的幼苗进行重复3次进行测定，检测结果见图5～7。

由图5结果可见：采用相同的引物相同的退火温度，对样品进行连续3次的检测，能跑出亮带的品种类型一致，该方法的重现性较高。

3 结论与讨论

长穗偃麦草是普通小麦的野生近缘种，其基因组DNA序列与小麦具有很高的同源性［3］，本试验结果表明，应用琼脂糖凝胶电泳法可以检测3个组合中导入的长穗偃麦草基因。琼脂糖凝胶电泳法所取的样品为小麦的叶片，取样后并不影响小麦的正常生长，且可以重复取样。该方法不仅重现性好，而且测得的结果较为稳定，准确度高，亮带明显。由此可见，应用这一技术，可以大规模筛选已导入某一基因的植株，检验小麦杂交成功与否。