金鸡颗粒中两面针掺伪检测方法的研究

胡亮，李瑞莲，王银红*

1.湖南省药品检验研究院，湖南药用辅料检验检测中心，长沙 410001；2.湖南省药品质量评价工程技术研究中心，长沙410001

金鸡颗粒处方由金樱根、鸡血藤、两面针、功劳木、穿心莲和千斤拔6味药材组成，具有清热解毒、健脾除湿、通络活血等作用，通常用于湿热下注引起的附件炎、盆腔炎等症［1-4］，其质量标准收载于《卫生部药品标准》［5］。两面针为芸香科植物两面针Zanthoxylum nitidum（Roxb.）D C.的干燥根。具有活血化瘀，行气止痛，祛风通络等功效［6-8］。金鸡颗粒现行质量标准中未对两面针进行质量控制，同时《中国药典》2015 年版一部收载的两面针药材项下明确规定应不得检出毛两面针素［6］，但现实状况是两面针药材的资源不足，两面针常见混有伪品飞龙掌血（特征成分为毛两面针素）等，实际生产中可能存在替代两面针投料生产的情况［9-10］。

本文采用薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱-质谱法（LC-MS）建立了金鸡颗粒中毛两面素的检查方法［11］，并对收集的21 批样品进行检查研究，具体方法如下。

1 仪器与试药

Waters Xevo G2 Q-TOF 液质联用仪；Waters 2695 液相色谱仪；2998 二级管阵列检测器（沃特世科技有限公司）；METTLER AE240 型电子天平（梅特勒-托利多，万分之一）；XSE205DU 型电子天平（梅特勒-托利多，十万分之一）；超声波清洗仪KQ500DE（500W，40KHz）；进口硅胶G 预制板TLC Silica gel 60（Merck）。毛两面针素对照品（中国食品药品检定研究院，批号111531-201603）；乙腈为色谱纯（Fisher Chemical），其他试剂均为分析纯。样品来源为国家食品药品监督管理总局国家药品评价抽验工作金鸡系列品种抽验样品及企业提供的部分样品。

2 方法与结果

2.1 两面针薄层色谱鉴别

取本品8 g，研细，加水30 mL 使溶解，用浓氨试液调pH 值至11，用二氯甲烷振摇提取2 次，每次30 mL，合并二氯甲烷提取液，蒸干，残渣加1 mL 二氯甲烷使溶解，作为供试品溶液。另取两面针对照药材1 g，加水30 mL，煮沸30 min，放冷，自“用浓氨试液调pH 值至11”起，同法制成对照药材溶液。按处方工艺制成不含两面针的样品，同供试品溶液制备方法制成缺两面针阴性对照溶液。照薄层色谱法（中国药典2015 年版四部通则0502）试验，吸取上述两种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-浓氨试液（40∶1∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光365 nm 下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰，斑点清晰，分离度较好,见图1。

图1 两面针薄层色谱鉴别图

2.2 两面针掺伪研究

2.2.1 薄层色谱（TLC）检查取本品8 g，研细，加乙醇40 mL，密塞，超声处理40 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1mL 使溶解，作为供试品溶液。取毛两面针素对照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015 年版四部通则0502）试验，吸取对照溶液5 μL，供试品溶液10 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液（20 ∶5 ∶3 ∶1 ∶0.18）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，出现与毛两面针素相同颜色的斑点，提示可能存在用两面针混伪品投料的情况,见图2。

图2 毛两面针素薄层色谱鉴别图

2.2.2 高效液相色谱（HPLC）检查对照品溶液的制备：取毛两面针素对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1 mL 中含30 μg 的溶液，作为对照品溶液。供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率500 W,频率40 KHz）40 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。阴性对照溶液的制备：另按颗粒剂处方称取除两面针外的其他药味及辅料适量，按照样品制备工艺，同法制备阴性对照溶液。色谱条件与系统适用性试验：采用Hypersil BDS C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：35℃；流动相：乙腈-0.1%磷酸（21 ∶79）；PDA 检测器，流速：0.8 min/mL；检测波长：330 nm。理论塔板数按毛两面针素峰计算应不低于3 000。取金鸡颗粒阴性样品溶液、毛两面针素对照品溶液和初筛显阳性样品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图,见图3。

图3 高效液相色谱图

采用二极管阵列检测器比较相应色谱峰在200～400 nm 波长范围的紫外吸收光谱，初筛显示金鸡颗粒阳性样品溶液与毛两面针素对照品溶液的PDA 检测紫外吸收光谱图基本一致，见图4。

图4 紫外－可见吸收光谱图

2.2.3 液质联用（HPLC-MS/MS）确证3批疑似阳性样品采用HPLC-MS/MS 进行确认，结果均出现与毛两面针素对照色谱保留时间相同的色谱峰，且相应的提取离子流色谱图与对照品一致。具体条件为：ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（1.8 μm，50 mm×2.1 mm）；以乙腈-10 mmol醋酸铵溶液（18∶82）为流动相；柱温30 ℃；电喷雾电离源（ESI），正离子模式，毛细管电压2.5 kv，锥孔电压40 V，萃取锥孔电压4.0 V，脱溶剂温度350 ℃，鞘气流速600 L/h。毛两面针素对照品溶液ESI+分子离子峰为m/z 309.13，与其结构吻合。对照品溶液及阳性样品溶液一级质谱和二级质谱扫描图见图5。

图5 液质联用分析图

2.2.4 筛查结果在本次筛查的21 批次样品中，共有3 批金鸡颗粒样品检出毛两面针素，阳性样品色谱保留时间与对照品色谱保留时间一致，且样品峰在210～400 nm 波长范围的紫外吸收光谱与对照品基本一致。对3 批次阳性样品采用HPLC-MS/MS进行确认，出现与毛两面针素对照品色谱保留时间相同的色谱峰，且与对照品的二级质谱图一致。涉及样品含量范围为65.48～73.94 μg/g。

2.3 HPLC含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备精密称取毛两面针素对照品12.22 mg，置50 mL 量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液①（244.4 μg/mL），精密量取对照品溶液①3 mL 置10 mL 量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液②（73.32 μg/mL）。

2.3.2 供试品溶液的制备及色谱条件供试品溶液的制备及色谱条件均同“2.2.2”项。

2.3.3 线性关系考察精密吸取对照品溶液②1、5、8、10 μL，对照品溶液①5、10 μL 注入液相色谱仪，测定，以峰面积积分值为纵坐标，进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程为：Y=3×106X-2.03×105，R2=0.999 5。结果表明：毛两面针素对照品在0.073 32～2.444 μg 范围内线性关系良好。

2.3.4 精密度试验精密吸取对照品溶液②（73.32 μg/mL），连续进样6次，每次10 μL，分别记录峰面积，计算RSD 为0.74%，结果表明仪器精密度良好。

2.3.5 重复性试验取金鸡颗粒（批号20160101），分别按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液各6 份，进样10 μL 进行分析，金鸡颗粒中毛两面针素含量平均值为71.53 μg/g，RSD 为1.69%。结果表明该法重复性良好。

2.3.6 稳定性试验取“2.3.6”项下金鸡颗粒同一份供试品溶液，室温下放置，在0、2、6、12、22 h分别进样10 μL 进行分析，分别记录峰面积，计算RSD 为0.48%，结果表明供试品溶液在22 h 内稳定性良好。

2.3.7 加样回收率试验取已测定含量的样品（20160101，含毛两面针素71.53 μg/g）2.0 g，共6 份，分别精密称定，置已精密加入对照品溶液②（73.32 μg/mL）1.80 mL 蒸干后的具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，密塞，称定重量，超声处理40 min，放冷，称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。在上述液相色谱条件下进样分析，按外标法计算加样回收率，6 批样品平均回收率为94.3%，RSD 为0.61%。结果表明该法加样回收率较好。

2.3.8 检出限和定量限精密量取“2.3.1”项下毛两面针素对照溶液①（244.4 μg/mL）1 mL 置200 mL 容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，得对照品溶液③（1.222 μg/mL），根据进样量不同，以信噪比为3∶1 的浓度作为仪器检出限，信噪比为10 ∶1 的浓度为仪器定量限，测定其检出限和定量限分别为1.22 ng 和3.44 ng。

2.3.9 样品测定取金鸡颗粒阳性样品，照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样10 μL 进行测定，用外标法计算含量，测定结果表明3 批次毛两面针素平均含量为70.31 μg/g，其中最高为73.94 μg/g，最低为65.48 μg/g。

3 讨论

由于两面针药材生长周期较长，需求量逐年增加而野生资源不断减少，导致两面针市场混伪现象严重，造成临床疗效和用药安全隐患。本文建立了金鸡颗粒中两面针的薄层色谱鉴别方法，同时对21批次样品进行毛两面针素检查。结果表明，21 批次样品中3 批次检出毛两面针素，检出率为14%，表明可能存在用两面针混伪品投料生产的情况，应对中成药制剂中的掺伪或伪品投料情况引起高度重视，并加强监管力度。