金匮肾气丸对伊马替尼所致小鼠生殖毒性及其在血、睾中含量影响研究

朱思晗 王玲玲 陈晓霞* 常晓慧

1.辽宁中医药大学研究生学院，辽宁 大连 110066；2.解放军联勤保障部队第967医院，辽宁 大连 110000

慢性粒细胞白血病(Chronic Myelogenous Leukemia，CML)是一种较为常见的，由于骨髓造血干细胞异常克隆所产生的血液性疾病。由于t(9；22)(q32；q21)易位(Ph′染色体)，形成 Bcr-Abl 融合基因，继而编码融合蛋白p210 Bcr-Abl，其酪氨酸激酶活性被异常激活，产生持续的细胞增殖信号致白血病发生[1-2]。随着现代医疗技术的不断发展，各种新型的治疗药物相继产生，对于治疗慢性粒细胞白血病起着重要作用[3]。其中，伊马替尼可以和Abl酪氨酸激酶ATP的结合位点特异性结合，进而隔绝ATP与Abl结合，避免Abl诱导细胞增生所需能量[4]，成为了临床治疗慢粒的主要药物之一。而随着CML的发病年龄要比以往流行病学调查的平均发病年龄略低趋势，患有CML的年轻人数量正逐渐增多。有大宗病例报道显示，女性患者服用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)期间意外妊娠者绝大部分在发现怀孕后停药后，有近10%的畸胎率[5]。因此，伊马替尼对CML患者生育和生殖的影响，成为临床医生及CML患者共同关注的问题。课题组前期研究表明，伊马替尼可对男性产生生殖毒性，本课题组在前期研究基础上[6]，对伊马替尼所致的男性生殖毒性进行分析，发现临床有些病例出现了水钠潴留、阳虚畏冷症状，故在中医藏象学说“肾主生殖 ”理论指导下，选择了经典方剂中具有补肾阳，化气行水的金匮肾气丸，与伊马替尼共同口服给予小鼠，来研究其对伊马替尼引起雄性小鼠生殖毒性拮抗作用，为临床上符合阳虚症状服用伊马替尼的慢粒男性患者采用中成药金匮肾气丸降低副作用，提高患者生活及生育质量提供理论支持。

金匮肾气丸出自《金匮要略》，该方配伍严谨，疗效显著，被称为“补肾诸方之祖”，深受历代医家推崇，至今仍在临床上广泛应用[7]。此方由附子、肉桂、熟地黄、山药、山茱萸、牡丹皮、茯苓、泽泻等组成，临床观察报道，金匮肾气丸治疗肾阳虚不育有效，并且能显著改善氧化应激损伤，提高精液量、精子活动率及精子浓度等指标[8]。本研究通过实验，观察金匮肾气丸拮抗伊马替尼引起雄性小鼠生殖毒性的疗效，报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 甲磺酸伊马替尼(Novartis Pharma Schweiz AG，Switzerland H20100263)、金匮肾气丸(北京同仁堂Z11021115)、伊马替尼对照品(纯度为 99.7%，中国食品药品检定研究院，批号分别为20140213)；乙腈(TEDIA，色谱纯大连铭扬实验试剂有限公司)、去离子水(娃哈哈有限公司)、其他试剂均为分析纯；电子精密天平(上海贵虎实业发展有限公司)、光学显微镜(上海光学仪器厂)、细胞计数板(海德生物有限公司)、低温离心机(盐城市凯特实验仪器有限公司)、岛津UFLC液相色谱仪(日本岛津公司)、ABSCIEXQTRAP 4500质谱检测器(美国AB公司)。

1.2 方法

1.2.1 染毒方法 由辽宁长生生物制剂有限公司提供6～8周龄健康雄性昆明小鼠70只，合格证号：SCXK(辽)2010-001，体量(20±2)g，适应性喂养1周后，随机分为对照组(Cont)，伊马替尼低(L-IM)、中(M-IM)、高(H-IM)剂量染毒组，金匮肾气丸低(L-IM+JIN)、中(M-IM+JIN)、高(H-IM+JIN)剂量拮抗组，每组10只；染毒组和拮抗组小鼠分别给予66.70、100.00、133.33 mg/(kg·d)0.3%CMC-Na伊马替尼溶液，1次/d，每周6 d，连续8周；拮抗组小鼠给予0.3%CMC-Na伊马替尼的同时，分别给予660.00、1330.00、2670.00 mg/(kg·d)金匮肾气丸水溶液，1次/d，每周6 d，连续8周，给药期间所有小鼠均自由饮食饮水。

1.2.2 样品采集及脏器系数 小鼠末次给药结束后1h，摘眼球取血，断颈法处死，迅速摘取双侧睾丸，两侧睾丸称重，计算脏器系数。脏器系数=睾丸重量(g)/小鼠体质量(g)×100%，左侧睾丸迅速冻存于-20 ℃冰箱，用于含量测定，右侧睾丸用于精子数量测定。

1.2.3 精子数量 取右侧睾丸少许，加1 mL 0.9%生理盐水稀释，精密吸取0.1 mL，放入血细胞计数板中，使精液自然流入计数板，计数中间5个方格的精子数，计数时每份精子用3个计数板重复计数3次，取3次均值。

1.2.4 各组小鼠血液及睾丸中伊马替尼浓度检测

1.2.4.1 质谱条件 为了提高方法的最佳灵敏度，优化离子源为ESI源；源喷射电压为3.5kV；加热毛细管温度为250℃；鞘气(N2)压力为80psi；辅助气(N2)压力为100psi；碰撞气(Ar)压力为20psi；正离子方式检测；碰撞诱导解离(CID)电压均为25eV；扫描方式为多反应监测(MRM)；用于定量分析的离子反应分别为m/z 494.1→393.9(伊马替尼)和m/z 447.2→397.0(内标，氘4伊马替尼)。

1.2.4.2 色谱条件 色谱柱为CAPCELLPAK- C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相由含有2 mM乙酸铵和0.05 %三氟乙酸( TFA )的去离子水(溶剂A )和0.05 % TFA的MeOH /乙腈( 1∶1，V / V ) (溶剂B )组成，流速为0.1 mL/min；柱温为45 ℃；进样量：5 μL。

1.2.4.3 储备液及工作溶液配制 精确称取伊马替尼对照品适量(相当于伊马替尼20.0 mg)，置于20 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，得1.0 mg/mL的伊马替尼储备液，储存于4 ℃冰箱避光保存备用。然后精密量取1.0 mg/mL的伊马替尼储备液50 μL，加入950 μL流动相，配成质量浓度为50 μg/mL的工作液。另配制质量浓度为1 μg/mL的内标甲醇溶液，备用。

1.2.4.4 血浆样品的处理 取血浆50 μL置事先预备的加肝素抗凝EP管中，后加10 μL内标溶液(1 μg·mL-1)及200 μL甲醇溶液，漩涡振荡2 min充分混合，4 ℃，12000 r/min条件下离心10 min，然后取上清液5 μL用于LC-MS/MS分析。

1.2.4.5 精液样品的处理 取小鼠的一侧睾丸用于伊马替尼浓度测定，分离睾丸中的睾丸液，37°水浴30 min液化，3000 rpm离心15 min，取上清。后加10 μL内标溶液(1 μg·mL-1)及200 μL甲醇溶液，漩涡振荡2 min充分混合，4 ℃，12000 r/min条件下离心10 min，然后取上清液5 μL用于LC-MS/MS分析。

1.2.4.6 标准曲线 取正常组血样、睾丸液若干份，分别加入不同浓度的伊马替尼标准溶液和内标溶液，制得浓度分别为1、12.5、25、50、100、250、500、1000 ng/mL的标准溶液。

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1 专属性 按“1.2.4”项下试验条件，分别测定6只不同小鼠空白血样、空白血样+伊马替尼/内标物和给药干预组小鼠血样，结果表明，小鼠血样组织中的内源性物质不干扰伊马替尼和氘代伊马替尼的测定，小鼠血样中伊马替尼和氘代伊马替尼的保留时间分别为6.90 min和6.94 min，睾丸组织中伊马替尼和氘代伊马替尼的保留时间分别为6.63 min和6.61 min，方法具有较高的特异性。

1.2.5.2 线性关系考察 按“1.2.4”项处理后作LC-MS/MS分析，以空白血清或睾丸中伊马替尼与内标物峰面积之比(Y)对药物浓度(C，ng/mL)线性回归(加权系数为1/C2)，拟合得标准曲线。得血清中测定曲线回归方程为：Y=0.0059X+0.0879,r=0.9969。 睾丸液中曲线回归方程为：Y=0.0016X+0.0294，r=0.9936。线性范围为1.0～2000.0 ng·mL-1，定量限(LLOQ)为1.0 ng·mL-1。

1.2.5.3 回收率 按“1.2.4”项下试验条件制备伊马替尼低、中、高3种质量浓度(5.0、25.0和250.0 ng·mL-1)的血样和睾丸组织质量控本(每种浓度6个重复)，以每一种浓度常规质控样本中伊马替尼峰面积平均值除以同浓度参比样本中伊马替尼峰面积平均值来计算提取回收率。在本文条件下，血样质量控本中伊马替尼低、中、高3种质量浓度回收率分别为(83.4±3.2)%、(87.0± 1.5)%、(85.2±1.1)%，RSD 分别为 3.0%、2.7%、1.3%；内标氘代伊马替尼分别为(94.9±1.8)%、(91.0±2.8)%、(94.1±2.7)%，RSD分别为1.4%、3.2%、1.7%。睾丸组织质量控本中伊马替尼低、中、高3种质量浓度回收率分别为(93.4±2.2)%、(84.2± 1.7)%、(80.9±2.1)%，RSD 分别为1.0%、1.9%、2.3%；内标氘代伊马替尼分别为(92.1±2.8)%、(89.0±2.7)%、(84.9±1.7)%，RSD 分别为 2.4%、1.8%、2.4%。

1.2.5.4 精密度与准确度 按“1.2.4”项下试验条件制备25.0、50.0、100.0 ng·mL-13个浓度的标准血样与睾丸组织样品作为质控样品，每一浓度各15份，每天分别取3个浓度各5份，连续测定3 d，伊马替尼血样与睾丸组织样品的精密度与准确度RSD均小于15%，符合生物样品测定要求。

1.2.5.5稳定性 按“1.2.4”项下试验条件制备5.0、25.0、50.0、100.0、250.0、500.0 ng·mL-16个浓度的空白血样与睾丸组织质控样品，每一浓度数份，分别考察于室温放置2 h，样品处理后4 ℃放置24 h，-70 ℃冻存30 d和-70 ℃冻融循环3次的稳定性，上述条件下RSD均小于10%，空白血样与睾丸组织质控样品在上述条件下稳定性良好，符合生物样品测定要求。

2 结果

2.1 体重及外观 分别称量各组小鼠第1周、第4周、第8周的体重，仅第四周时，L-IM+JIN组与Cont组差异有统计学意义(P<0.05)。另外8周时间中，Cont组体重持续平稳，染毒组随着伊马替尼给药剂量增加、给药时间延长，小鼠体重逐渐增加。拮抗组经金匮肾气丸给药后，小鼠体重有不同程度减轻。如图1所示。

图1 各组小鼠第1周、第4周、第8周体重注：与Cont组比较，☆P<0.05。

2.2 脏器系数 与Cont组比较，各组小鼠睾丸系数差异无统计学意义(P>0.05)，H-IM组睾丸系数有下降趋势，而经金匮肾气丸治疗后，拮抗组睾丸指数均有上升趋势。如图2所示。

2.3 精子数量 H-IM+JIN组与Cont组比较差异有统计学意义(P<0.01)，染毒低、中、高组小鼠精子数量均有下降趋势，同剂量金匮肾气丸与伊马替尼联合用药组与伊马替尼组相比，均能显著性增加精子数量，差异有统计学意义(P<0.01)。如图3所示。

图2 各组小鼠脏器指数 图3 各组小鼠精子数量注：与Cont组比较，☆☆P<0.01；同剂量金匮肾气丸与伊马替尼联合用药组、伊马替尼组比较，**P<0.01。

2.4 血浆及睾丸组织中伊马替尼药物浓度的检测 采用LC-MS/MS检测各组血液及精液中伊马替尼药物浓度。血液中，M-IM组与M-IM+JIN组比较有统计学意义(P<0.05)，小鼠血液中药物含量最高，在经金匮肾气丸给药后，各组小鼠血液中伊马替尼浓度均有所增加。精液中，M-IM组与M-IM+JIN组比较有统计学意义(P<0.01)，在经金匮肾气丸给药后，中剂量组小鼠精液中伊马替尼浓度有所降低。如图4、5、6所示。

A.血样对照品；B.血样样品；C.睾丸组织对照品；D.睾丸组织样品图4 伊马替尼药物浓度测定及内标测定质谱图

图5 血清中伊马替尼药物浓度 图6 睾丸中伊马替尼药物浓度 注：M-IM组与M-IM+JIN组比较，*P<0.05。 注：M-IM组与M-IM+JIN组比较，**P<0.05。

4 讨论

伊马替尼是治疗慢性粒细胞性白血病和恶性胃肠道间质肿瘤的一线药物，其生殖毒性也是公认的，长时间服用可导致不可逆的少弱精子症，少弱精子症属于中医“精冷”“精少”范畴，人体生殖器官的发育、生殖功能的成熟与维持均与肾藏精和肾气温煦的功能相关。肾精化肾气，肾精充足和肾气旺盛，则生殖功能正常，反之则弱。因此，在少弱精子症的治疗上，始终离不开补肾法[9]。

金匮肾气丸为传统补肾名方，具有滋补肾阴、填补肾精、温补肾气的功效。大量临床及试验研究显示，补肾中药具有修复生殖损伤的作用。王秋萍、肖惠英等[10-11]指出肾气丸能明显改善少弱精子症动物精子活力，改善精子密度，提高精子质量。祖国传统医学认为: 精子质量低下，表明肾阳亏虚。所以，中医治疗弱精子症，多采用温补肾阳为治疗大法。目前市面上售金匮肾气丸实为《济生方》中济生圣气丸，较《金匮要略》组中金匮肾气丸多了两味牛膝、车前，这两味药的加入增加了化气利水消肿的作用，对于肾阳不足、水湿内停所致的肾虚水肿、小便不利更为适宜[12-13]。

本研究中结果显示，伊马替尼染毒组子数量有所下降，说明伊马尼染毒雄性小鼠的生殖损伤模型建立成功。现有文献报道诊断肾阳虚证动物模型的客观指标[14-15]主要有反映下丘脑-垂体-靶腺轴功能低下、睾丸出现组织学改变等，据200余篇有关肾阳虚动物模型文献中症状体征描述显示：其表现主要有体重下降, 体温下降, 畏寒蜷缩, 反应迟钝, 精神委靡, 体毛枯疏, 失去光泽, 饮水摄食减少, 尿量增多等, 个别有性功能低下。伊马替尼染毒的小鼠符合肾阳虚证的动物模型，可用于金匮肾气丸治疗肾阳虚证的药理评价[16]。在雄性生殖系统中[17]，睾丸具有精子的发生和雄性激素合成两大功能，染毒组小鼠精子数量下降趋势明显，伊马替尼可能在形成精子过程中产生毒性作用而导致精子数量减少[18]。此外，染毒组血浆与睾丸组织药物浓度，M-IM组药物浓度达到最高，可能原因是，伊马替尼致雄性小鼠生殖系统产生毒性作用有最高剂量，而经金匮肾气丸拮抗后，伊马替尼在血液中的浓度有所增加，在睾丸组织中，M-IM组药物浓度有所下降，这一结果说明，金匮肾气丸能够增加伊马替尼在血液中的浓度，提高伊马替尼治疗CML的靶向性作用，减少伊马替尼在睾丸组织中的浓度，降低伊马替尼对雄性小鼠的生殖毒性。

虽然目前此类研究尚少见报告，但课题组正在研究应用补肾中医干预接受伊马替尼治疗的慢性粒细胞性白血病白血病患者，动物实验表明能够较好改善应药物导致的精子数目减少、活动力减低，改善精液治疗，保护生殖力。