2016-2019年重庆市细菌学涂片革兰染色项目室间质评结果分析

王淑玲，颜 令，徐兰兰，张 震，李 甜，廖 璞

中国科学院大学重庆医院/重庆市人民医院检验科，重庆 400014

尽管目前病原微生物检测发展到高通量测序阶段，但涂片检查仍然是病原学最直接、最经济的手段。为提高重庆市临床微生物实验室形态学显微镜检查(简称镜检)能力，重庆市临床检验中心于2016年开展了细菌学涂片革兰染色项目室间质评，至2019年度已开展了8次细菌学涂片革兰染色项目，为了更好地发现问题，提高镜检水平，本研究对2016-2019年重庆市细菌学涂片革兰染色项目室间质评结果进行分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1标本来源 准备洁净、干燥玻片备用，配制一定浓度生长期为对数期的细菌；取5 μL标本在玻片偏右侧中央涂抹一椭圆形菌膜，自然干燥；紫外灯照射30 min；酒精灯火焰上方固定；贴标本标签，将贴好的玻片放入标本盒中，标本盒外贴上项目标签，并用胶布封住盒口。于室温下避光干燥保存[1]。

1.2质评方法 室间质评标本发放由重庆市临床检验中心统一发放，每年发放2次室间质评标本，每次5个标本。实验室在收到信息后按照通知立即检测或放置室温保存，在规定日期前检测和上报。检测时按照实验室临床标本处理流程进行。

1.3评价方法 依据2018能力验证结果的统计处理和能力评价指南：CNAS-GL002[2]，统计参评实验室对质评标本的测定结果与预期结果的符合程度。参照临床检验室间质量评价：WS/T644-2018[3]对于定性测定能力评价要求参评实验室对质评标本的测定结果与预期结果的符合程度，根据符合率来判断参评实验室的能力是否合格。对每一个检测项目的评价：本次某项目测定得分=某项目测定结果可接受标本数/某项目标本总数×100。对于所有检测项目的评价：本次所有项目测定得分=所有项目测定结果可接受标本数/标本总数×100。得分≥80分为合格。

2 结 果

2.1参加细菌学涂片革兰染色并上报数据实验室数及合格率 细菌学涂片革兰染色项目室间质评的医院数从2016年的52家增加至2019年的105家，合格率从2016年的84.6%增加到2019年的93.3%。见表1。

表1 2016-2019年参加细菌学涂片并上报数据实验室数和合格率

2.2参加细菌学涂片革兰染色实验室构成及合格率 2016-2019年参加细菌学涂片的实验室主要是综合性二、三级医院和中医院实验室，民营医院实验室和独立实验室也逐步加入，合格率整体呈上升趋势。见表2。

2.32016-2019年涂片革兰染色镜检结果 2016-2019年涂片革兰染色镜检总体结果：革兰阳性球菌合格率为98.9%，革兰阴性杆菌合格率为95.0%，未发现细菌、真菌的革兰阴性球菌合格率为94.7%，革兰阳性杆菌合格率为94.8%，真菌合格率为95.0%，未发现细菌、真菌的阴性标本合格率稍低，为87.8%。2016-2019年涂片革兰染色镜检结果见表3。

2.4涂片革兰染色仪器使用情况 使用全自动染片仪的实验室占6.7%，手工染色仍是主力，占93.3%。

表2 2016-2019年参加细菌学涂片实验室构成和合格率

续表3 2016-2019年涂片革兰染色镜检结果

3 讨 论

世界卫生组织(WHO)对临床微生物实验室提出的指导性方针之一是镜检对建立快速的初步诊断具有很大价值。即便在高通量测序、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱及PCR技术等手段发展的当前，细菌涂片仍不可取代[4]。微生物检验一定要坚持原始标本的直接涂片，注意导致感染的病原菌和人体免疫反应间的相关性[5-7]。革兰染色监测不仅是实验室必不可少的质量控制工具，而且对于建立跨实验室的质量控制非常必要[8]。全国各医院检验科ISO 15189认可实验室评审和各级医院评审均对细菌学涂片提出要进行实验室间比对等要求。

随着实验室规范化建设的进展，质控意识日益增强，重庆市各级医学实验室积极参加，由2016年最初的52家增加到2019年的105家，综合三级医院实验室由20家增加到30家，综合二级医院实验室由22家增加到41家，中医院实验室由8家增加到18家，妇幼保健院实验室由1家增加到7家，民营医院由0家增加到5家。经过8次项目开展，实验室合格率逐年升高，由2016年的84.6%提升到2019年的93.3%，细菌形态学镜检正确率明显提高。在一项新德里印度医学微生物学协会举办的室间质评活动中，革兰染色正确率分别为29.6%～79.9%，77.0%的参与实验室在测试中总分>80%[9]，较重庆市的正确率低，究其原因为其发放的是临床标本，重庆市发放的是培养物模拟标本。西非布基纳法索举办的室间质评活动中，革兰染色正确率为87.0%[10]。GUARNER等[11]报道了由参考微生物学实验室从培养物制备的5个标本，革兰染色正确率为73%～96%。

随着项目的开展，笔者发现了一些问题，也针对问题进行强化，同时也加大形态学检验难度。2016年165223号标本为肺炎克雷伯菌模拟血培养制备的涂片，镜下为革兰阴性杆菌，单个或成对排列，因为肺炎克雷伯菌在血培养瓶里营养丰富，生长良好，形态比固体培养基上要圆，80.0%实验室报告正确，部分实验室报告为革兰阴性球菌。随着侵袭性真菌在临床检测的重要性越来越高，笔者对2017年201715号标本进行丝状真菌的染色镜检，镜下为丝状真菌菌丝，但有20家实验室未观察到真菌菌丝。因为丝状真菌菌丝较大，染色镜检需低倍镜浏览全片，待找到视野后再用油镜观察，若直接油镜观察会造成丝状真菌漏检。为了降低对丝状真菌的漏检，2019年又进行了此类标本发放，201915号标本镜下为曲霉菌丝，此次有7家实验室漏检，正确率由73.2%逐步提高到91.3%。2018年201812号标本是第1次发放的阴性标本，正确结果为未发现细菌、真菌。但有16家实验室报告发现了细菌，可能把染料残渣看成了细菌，需要加强实验室革兰染色的室内质控，减少错误的判断。笔者针对出现的问题进行分析，细菌形态学镜检正确率逐步提高。

革兰染色显微镜镜检对染色过程和显微镜镜检均有要求。目前，重庆市实验室革兰染色使用染片仪有7家，绝大多数是手工染色。而手工染色更需要做好室内质控，保证试剂的有效和操作过程的正确。显微镜镜检与一般检测不同，要求人员具有丰富的形态学检验工作经验，具备一定的临床知识和综合分析能力。在实际工作中，由于标本性质、细菌本身对染液的亲和力及细菌受到药物影响后形态的变异等因素，往往给细菌的识别带来很大的困难，这需要依靠开展培训和不断实践来提高。

综上所述，开展细菌学涂片革兰染色项目可以检验实验室结果准确性，及时发现实验室存在问题，并针对出现的问题进行总结，从而为临床诊疗提供快速、可靠的微生物形态学镜检结果。