恶性胸膜间皮瘤中EFEMP1基因mRNA的表达及其临床病理学意义

杨娜，李彬，李素芬，王唯斯，自加吉，熊伟，2

1.大理大学 基础医学院 a.生物化学与分子生物学教研室；b.病理学教研室；云南 大理 671000；

2.云南省高校临床生物化学检验重点实验室，云南 大理 671000

恶性胸膜间皮瘤（malignant pleural mesothelioma，MPM）是一种来源于胸膜间皮细胞的原发肿瘤，占胸膜肿瘤的5%，临床少见[1]。胸膜间皮瘤可发生于脏层胸膜和壁层胸膜的任何部分，80%发生于脏层胸膜，20%发生于壁层胸膜；可发生于任何年龄，常见于40～60岁[1]。胸膜间皮瘤是由环境、生物和遗传因素引起的肿瘤。石棉已被国际癌症研究中心（IARC）确定为致癌物[2]，在美国和西方国家石棉被认为是导致恶性间皮瘤的主要原因。在不同国家，MPM的发病率差异较大，国外以澳大利亚最高，发病率约为3.54/10万，国内每年发病率为0.3/10万～0.5/10万，以云南省最高，约为8.5/10万～17.75/10万[3-4]。目前对该病的诊断及治疗较棘手，早期诊断可以提高MPM患者的生存率，一些用于早期诊断的分子标志物如间皮素（mesothelin），癌胚抗原（CEA），糖类抗原CA125、CA153、CA199和细胞表明标志物CD90等的敏感性和特异性均有限[5]。目前，MPM的诊断金标准仍为胸腔镜活检，缺乏较为便捷有效且低痛苦的诊断方法，发掘新的MPM诊断方法能够为患者的早期诊断和治疗提供依据。

人表皮生长因子含纤蛋白样胞外基质蛋白1（epidermal growth factor containing fibulin like extracellular matrix protein 1，EFEMP1）基因定位于染色体2p16.1，含有12个外显子，编码产物为纤蛋白3（fibulin 3）[6]。纤蛋白家族共7个成员，纤蛋白3含有493个氨基酸残基，在不同物种中高度保守，在人类、大鼠和小鼠中92%～94%的氨基酸序列同源。纤蛋白3是一种细胞外糖蛋白，广泛分布于发育中的组织与成熟组织中，在生理条件下通常以单体形式存在。研究发现，纤蛋白3在MPM患者的血浆和胸水中水平显著升高，且敏感性和特异性较高[7-8]。目前，EFEMP1基因表达与MPM发生发展的关系尚不明确。因此，本研究旨在阐明EFEMP1基因mRNA在MPM组织中的表达情况，并进一步探讨其与临床病理参数及患者预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 利用Oncomine数据库分析EFEMP1基因mRNA在MPM组织与非肿瘤组织中的表达

Oncomine数据库是目前最大的肿瘤基因芯片整合平台和分析平台，可用于对目标基因的筛选及该基因在不同组织中的表达分析。本研究在Oncomine数据库中设置条件为：①“Gene：EFEMP1”；②“Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis”；③“Cancer Type：Other Cancer-Mesothelioma-Pleural Malignant Mesothelioma”；④“Simple Type：Clinical Specimen”。对纤蛋白3在MPM组织与非肿瘤组织中的表达差异进行分析。

1.2 下载TCGA数据库中MPM数据集的病理资料与患者预后资料

使用R3.6.3软件，利用Epicalc函数包，从美国公共癌症基因数据库（The Cancer Genome Atlas，TCGA）（http://tcga-adtaa.nci.nih.gov/tcga/）中 下载并预处理MPM数据集中EFEMP1基因mRNA表达量的数据集，同时下载MPM患者的临床病理参数和预后资料，将2个数据集根据对应的TCGA病例编号进行合并。

1.3 对TCGA数据库中MPM数据集进行筛选及病理相关性分析

通过R3.6.3下载合并得到的数据集meso_tcga中包含87例MPM病例样本。通过对临床数据进行筛选比对，删除缺失数据及无效数据，仅保留完整有效的数据82例。根据RNA测序结果分析，MPM样本中EFEMP1基因表达量为1646.753～115 390.589，中位表达量为28 250.071。以中位表达量为截断值，样本中EFEMP1表达量高于中位数的定义为高表达（high），反之为低表达（low），2组均为41例。

1.4 MPM组织的病理学分型

TCGA数据库中MPM数据集将MPM组织的病理学分型分为3种，即肉瘤样型（Sarcomatoid Type）、上皮样型（Epithelioid Type）和双向混合型（Biphasic Type），依次分别包括2例、57例、23例。

1.5 EFEMP1基因mRNA表达水平对MPM患者预后的影响

采用基因表达谱动态分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）（http://gepia.cancer-pku.cn）数据库对数据构建Kaplan-Meier模型，探究EFEMP1基因mRNA表达水平与MPM患者预后之间的关系。

1.6 EFEMP1基因mRNA表达水平与其他基因表达的相关性分析

cBioportal（http://www.cbioportal.org/）是基于公共数据库研究分析癌症基因数据的可视化工具，通过自定义数据探求基因改变和临床之间的联系，并使其可视化。选择MPM组织和EFEMP1基因，可得出MPM中EFEMP1基因与其他基因表达的相关性可视化分析图。

1.7 统计学分析

建立MPM患者的临床病理数据集，将患者年龄、性别、AJCC病理分期、T分期、M分期、N分期、病理类型、组织学诊断和EFEMP1基因mRNA表达量进行量化赋值。采用R3.6.3和Graphpad Prism 8.0进行统计学分析及绘图，使用Shapiro-Wilk方法检测MPM组织中EFEMP1基因mRNA表达量的正态分布情况，结果显示EFEMP1基因mRNA表达量不符合正态分布（P＜0.05）。因此，MPM组织的EFEMP1基因mRNA表达量比较采用Mann-Whitney U非参数检验。组间比较采用χ2检验及Fisher精确概率法进行临床病理参数相关性分析。患者预后分析采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线并进行Logrank检验。采用Pearson或Spearman法进行基因表达的相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 EFEMP1基因mRNA在MPM组织中的表达量显著高于正常组织

对Oncomine基因芯片数据库数据筛选分析，所得结果显示在正常组织以及有关MPM的共54个样本中，与正常肺组织和正常胸膜组织相比，EFEMP1基因在MPM组织中的表达量显著升高，且组间差异极显著（P＜0.01），结果如图1。

2.2 MPM组织中EFEMP1基因mRNA表达量与临床病理参数的相关性

图1 正常组织与MPM组织中EFEMP1基因mRNA表达量差异

从TCGA数据库下载并整理得到临床病理参数完整的82例MPM病例资料，其中女性16例、男性66例，年龄28.0～81.0岁，中位年龄64.0岁。对该数据集中MPM患者预后的各影响因素进行赋值，通过统计学分析得知MPM组织中EFEMP1基因mRNA低表达41例、高表达41例。结果表明，EFEMP1基因mRNA表达量与MPM患者的T分期（P=0.046）、病理类型（P=0.031）及组织学诊断类型（P=0.031）存在显著相关性，而与患者的年龄、性别、N分期、M分期、AJCC病理分期均无显著相关性（均P＞0.05）。结果见表1。

2.3 EFEMP1基因mRNA表达量与MPM患者的预后无显著相关性

用GEPIA数据库构建Kaplan-Meier生存曲线并进行Logrank法检验，结果表明EFEMP1基因的表达对MPM患者的总生存率（overall survive，OS）及无疾病进展生存率（disease free survive，DFS）均无显著影响（LogrankP＞0.05）。结果如图2。

2.4 MPM组织中EFEMP1基因与其他基因mRNA表达量的相关性

通过cBioportal工具对MPM组织中EFEMP1基因表达相关性进行可视化分析。选取在MPM组织中EFEMP1基因表达相关性最高的9个基因，分别为UDP-葡萄糖焦磷酸化酶2（UDP-glucosepyrophosphorylase2，UGP2）、转 录 因 子 4（transcription factor 4，TCF4）、活化的T细胞核因子 4（nuclear factor of activated T cells 4，NFATC4）、RAS 相 关 基 因 2（rasrelated 2，RRAS2）、膜联蛋白 A3（annexin A3，ANXA3）、柔滑素（smoothelin，SMTN）、尿蛋白 1B（uroplakin 1B，UPK1B）、醇脱氢酶 6（alcohol dehydrogenase 6，ADH6）和DNA损伤识别和修复因子XPC复合体（XPC complex subunit，XPC）基因。其中，UGP2、RRAS2、ANXA3、UPK1B、ADH6、XPC与EFEMP1基因表达量呈显著正相关（P＜0.05），TCF4、NFATC4、SMTN与EFEMP1基因表达量呈显著负相关（P＜0.05）。结果见图3。

3 讨论

表1 EFEMP1基因mRNA表达量与MPM患者临床病理特征的相关性

图2 EFEMP1基因mRNA表达量与总生存率的关系

MPM是一种罕见的胸腔恶性肿瘤，起源于胸膜腔的间皮细胞[9]。MPM总体预后较差，上皮型MPM预后相对较好，肉瘤型预后最差，未经治疗的MPM中位生存期为12个月，6个月、1年和5年的生存率分别为55%、33%和5%[10]。MPM是一种致死性极强的肿瘤，其恶性程度高，潜伏期长，早期临床表现无特异性，多数患者被发现时已是晚期[11]。MPM在早发现、早诊断和早治疗等环节的检查技术薄弱，缺乏特异性诊断和预后的肿瘤生物学标记物。纤蛋白3可以单独表现出与组织特异性表达有关的抑癌或致癌行为[12-13]。研究显示，纤蛋白3在MPM患者中的表达水平普遍升高，且纤蛋白3不仅在肿瘤组织中过表达，在胸腔积液和血浆中也有较高水平的表达[14]。由此提出，纤蛋白3可能在MPM中起致癌作用。对MPM细胞系的体外研究及体内移植瘤研究进一步表明MPM细胞表达和分泌纤蛋白3，并且是患者血浆样本中纤蛋白3的来源。在生理情况下，纤蛋白3以单体形式存在，在正常组织中低表达，而在内皮细胞和上皮细胞的基膜中高表达，可介导细胞与细胞、细胞与间质之间的信号传导[15]。近年来许多实验也证明，纤蛋白3可正向调控多种肿瘤细胞的生长及分化增殖，并参与肿瘤细胞抗凋亡作用[16-18]。关于纤蛋白3在各种类型肿瘤中的研究，特别是在MPM中的表达及意义也越来越受到人们的关注。

图3 MPM组织中EFEMP1基因与其他基因mRNA表达量的相关性

在本研究中，我们首先通过数据挖掘分析了EFEMP1基因mRNA的表达与MPM发生之间的相关性，发现EFEMP1基因在正常肺组织或正常胸膜组织中均低表达，在MPM组织中显著高表达，并且EFEMP1基因mRNA的表达量与肿瘤的T分期、病理类型及组织学诊断类型有显著相关性。莫世贤采用随机效应模型，发现试验组（MPM组）患者血液及胸腔积液的纤蛋白3水平高于对照组（非MPM组）[19]。因此，纤蛋白3对于诊断MPM具有较高程度的敏感性和特异性，可作为MPM临床早期诊断的辅助方法。为了比较纤蛋白3与间皮素作为MPM相关生物标志物的价值，Creaney等采用ELISA测定了153例胸腔积液患者血浆和胸水中的纤蛋白3及间皮素水平，发现间皮素在诊断MPM方面优于纤蛋白3，而在判断患者预后方面则是纤蛋白3更优[20]。然而，本研究的预后生存分析结果显示，EFEMP1基因mRNA表达量与MPM患者的总体生存率和无疾病进展生存率之间并无显著关联。基因表达相关性分析表明，UGP2、RRAS2、ANXA3、UPK1B、ADH6、XPC与EFEMP1基因表达量呈显著正相关，TCF4、NFATC4、SMTN与EFEMP1基因表达量呈显著负相关，提示EFEMP1基因在MPM发生过程中可能需要与其他基因相互协同才能发挥作用。

MPM发病机制复杂，临床病例较为少见。本研究使用TCGA中MPM数据集的病例数据及预后资料，临床数据样本量更大，所得结果的可信度较高。综上研究表明，EFEMP1基因mRNA在MPM组织中过表达，它可以作为该疾病诊断的潜在生物标志物，这可为MPM的临床诊疗提供一定的参考。