长链非编码RNA SNHG16的表达对肺癌细胞增殖和化疗耐药影响的作用机制

姜翠红，赵志正，刘睿，修俊青，谭鑫，王佳

中国中医科学院 广安门医院南区肿瘤科，北京 102618

肺癌是威胁人类健康的主要癌症之一，患病率和死亡率较高，随着城市环境污染、人们生活方式的改变，其患病率依然逐年上升[1-2]。肺癌患者被确诊时往往已是晚期，并且其转移迅速，患者预后很差[2]。目前治疗肺癌主要有手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等方法[2-4]，其中手术、化疗和放疗为癌症的传统治疗手段，化疗由于会使肿瘤细胞产生耐药性，治疗效果不佳，亟待寻找抑制肺癌细胞化疗耐药的治疗手段[5]。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度大于200 nt不编码蛋白的RNA。研究表明，lncRNA在肿瘤发生发展和转移过程中发挥作用[5-6]。lncRNA SNHG16被称为小核仁RNA宿主基因16，最早在神经母细胞瘤中发现，已被证明在结直肠癌、胃癌及膀胱癌中具有致癌作用，但在肺癌中还罕见研究报道[7-9]。在此，我们主要探讨SNHG16的表达对肺癌细胞增殖和吉西他滨化疗耐药影响的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

肺癌患者组织及癌旁组织样本来自中国中医科学院广安门医院；肺癌细胞系HCC827、A549、NCI-H1395、NCI-H1975及肺上皮细胞系BEAS-2B购自中国科学院上海生科院细胞资源中心；胎牛血清、RPMI-1640培养基及DMEM培养基购自Gibco公司；F12K培养基购自Sigma公司；谷氨酰胺、丙酮酸钠购自Invitrogen公司；sh-SNHG16-1、sh-SNHG16-2、miR-520a-3p-inhibitor及 miR-520a-3p mimic购自苏州吉玛基因股份有限公司；RNA提取试剂盒及cDNA合成试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；SYBR GreenⅠ核酸染料购自ThermoFisher公司；SNHG16引物由北京博迈德基因技术有限公司合成；CCK-8细胞存活率检测试剂盒购自日本东仁化学公司；双萤光素酶报告基因试剂盒购自Promega公司；MRP1、MRP2、ABCG2转运蛋白一抗购自Abcam公司。

1.2 cDNA合成和qRT-PCR实验

提取细胞总RNA，Nanodrop检测RNA浓度，合成cDNA，合成样品于-20℃保存备用。采用荧光染料法进行实时荧光定量PCR实验。SNHG16上游引物为5'-CAGAATGCCATGGTTTCCCC-3'，下游引物为5'-TGGCAAGAGACTTCCTGAGG-3'；GAPDH上游引物为5'-ACGGGAAGCTCACTGGC ATGG-3'，下游引物为5'-GGTCCACCACCCTGTT GCTGTA-3'；miR-520a-3p 上游引物为 5'-GCAG AAAGTGCTTCCCTTTG-3'，下游引物为5'-GGTC CAGTTTTTTTTTTTTTTTACAGT-3'；U6上游引物为5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，下 游 引物为5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。

1.3 细胞培养和细胞转染

肺癌细胞系HCC827、A549、NCI-H1395、NCIH1975及肺上皮细胞系BEAS-2B分别采用RPMI-1640、F12K、RPMI-1640和DMEM培养基培养，HCC827、A549及BEAS-2B细胞完全培养基中胎牛血清∶培养基为体积比1∶9，NCI-H1395和NCIH1975细胞完全培养基中胎牛血清∶培养基∶谷氨酰胺∶丙酮酸钠为体积比88∶10∶1∶1。细胞在5% CO2、37℃恒温培养箱中培养。分为sh-NC组、sh-SNHG16-1组、sh-SNHG16-2组，采用LipofectAMINE 3000向已接种细胞的6孔板中转染，48 h后进行后续实验。

1.4 细胞增殖率检测

96孔板中按5×103/孔接种细胞，待细胞覆盖率达到50%左右，分别加入完全培养基稀释的0、5、10、20 μmol/L 的吉西他滨溶液，与细胞孵育48 h；弃去培养液，加入不含血清培养基配制的10% CCK-8反应液，将培养板继续置于37℃恒温培养箱培养40 min，酶标仪检测D450nm值。

1.5 双萤光素酶报告基因实验

构建载体，即含miR-520a-3p结合位点的WT-SNHG16及Mut-SNHG16插入pmir-GO，采用LipofectAMINE 3000将 miR-NC、miR-520a-3p mimics共转染肺癌细胞，48 h后分别检测萤火虫萤光素酶及海肾萤光素酶活性，结果表示为相对萤光素酶活性（萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶活性。

1.6 蛋白质印迹实验

用细胞裂解液于冰上裂解细胞，4℃、12 000 r/min离心10 min分离细胞碎片和上清液，Bradford法测定总蛋白含量。蛋白样品中加入适量的上样缓冲液，于100℃水浴锅中煮沸10 min后进行SDS-PAGE，然后恒流转膜2 h。将转好蛋白的PVDF膜置于TBST配置的5%脱脂奶粉中封闭1～2 h，加入一抗4℃孵育过夜，接着加入含辣根过氧化物酶的二抗常温孵育，ECL化学发光液反应，凝胶成像仪成像显影，拍摄蛋白条带结果。

1.7 统计学方法

采用GraphPad Prism 7.0对实验数据进行统计学分析检验，实验数据用x±s表示，组内两两比较采用LSD-t分析，组间比较采用单因素或双因素方差分析，检测水平α＜0.05（双侧），Shapiro-Wilk检测实验数据均服从正态分布。P＜0.05表示有显著性差异，具有统计学意义。

2 结果

2.1 SNHG16在肺癌组织和肺癌细胞系中高表达

采用qRT-PCR检测SNHG16在肺癌组织和细胞系中表达量，结果见图1，Shapiro-Wilk检测实验结果符合正态分布（均P＞0.05）。结果显示，SNHG16在肺癌组织和肺癌细胞系中表达量均明显高于相应的癌旁组织和正常肺上皮细胞系，差异具有统计学意义。

2.2 敲低SNHG16抑制NCI-H1395细胞增殖率和对吉西他滨耐药

慢病毒包装构建sh-SNHG16-1、sh-SNHG16-2，分为sh-NC组、sh-SNHG16-1组、sh-SNHG16-2组，采用qRT-PCR检测各组NCI-H1395细胞中SNHG16的表达量，结果见图2A，Shapiro-Wilk检测实验结果符合正态分布（均P＞0.05）。采用CCK-8检测3组NCI-H1395细胞增殖率，结果见图2B，Shapiro-Wilk检测实验结果符合正态分布（均P＞0.05）。sh-SNHG16-1、sh-SNHG16-2组细胞增殖率在12、24和48 h时明显低于sh-NC组，F时间=574，F组别=128.8，F时间×组别=16.7，均P＜0.001。采用CCK-8检测3组NCI-H1395对吉西他滨耐药的影响，结果见图2C，Shapiro-Wilk检测实验结果符合正态分布（均P＞0.05）。sh-SNHG16-1、sh-SNHG16-2组细胞存活率在吉西他滨浓度分别为5、10和 20 μmol/L时明显低于 sh-NC 组，F浓度=320.5，P＜0.001，F组别=44.83，P＜0.001，F浓度×组别=3.562，P=0.0053。以上结果表明，sh-SNHG16敲低SNHG16的表达量，抑制NCI-H1395细胞增殖率和对吉西他滨耐药，差异具有统计学意义。

2.3 SNHG16作为海绵抑制miR-520a-3p的表达

用starBase软件预测靶向SNHG16的miRNA，分为Vector组、SNGH16组，qRT-PCR检测各组miRNA的表达量，结果见图3A，Shapiro-Wilk检测实验结果符合正态分布（均P＞0.05）。双萤光素酶报告基因实验检测miR-NC、miR-520a-3p mimics组SNHG16野生型和突变型的相对双萤光素酶活性，结果见图3B，Shapiro-Wilk检测实验结果符合正态分布（均P＞0.05）。图3C为SNHG16野生型与miR-520a-3p结合位点。结果表明，增加SNHG16的表达明显降低miR-520a-3p的表达，增加miR-520a-3p的表达明显降低SNHG16野生型的相对萤光素酶活性，证明SNHG16作为海绵抑制miR-520a-3p的表达，差异结果均具有统计学意义。

图1 SNHG16在肺癌组织和肺癌细胞系中的表达量

图2 敲低SNHG16对NCI-H1395细胞增殖率及吉西他滨耐药的影响

图3 SNHG16作为海绵抑制miR-520a-3p的表达

2.4 SNHG16/miR-520a-3p对NCI-H1395细胞增殖率和对吉西他滨耐药的影响

分为sh-NC组、sh-SNHG16组、sh-SNHG16+miR-520a-3p-inhibitor组，qRT-PCR检测各组NCI-H1395细胞中miR-520a-3p的表达量，结果见图4A，Shapiro-Wilk检测实验结果符合正态分布（均P＞0.05）。采用CCK-8检测3组NCI-H1395细胞增殖率，结果见图4B，Shapiro-Wilk检测实验结果符合正态分布（均P＞0.05）。sh-SNHG16组细胞增殖率在12、24和48 h时明显低于sh-NC组，sh-SNHG16+miR-520a-3p-inhibitor组相比sh-NC组各时间细胞增殖率没有统计学差异（P＞0.05），F时间=1177，F组别=178.3，F时间×组别=39.93，均P＜0.001。采用CCK-8检测3组NCI-H1395对吉西他滨耐药的影响，结果见图4C，Shapiro-Wilk检测实验结果符合正态分布（均P＞0.05）。sh-SNHG16组细胞存活率在吉西他滨浓度分别为5、10和20 μmol/L时明显低于sh-NC组，sh-SNHG16+miR-520a-3p-inhibitor组相比sh-NC组各浓度对吉西他滨耐药没有统计学差异（P＞0.05），F浓度=231.7，P＜0.001，F组别=27.86，P＜0.001，F浓度×组别=2.391，P=0.042。采用蛋白质印迹检测 MRP1、MRP2、ABCG2转运蛋白的表达水平，结果见图4D。sh-SNHG16组3种转运蛋白表达水平明显低于sh-NC组，sh-SNHG16+miR-520a-3p-inhibitor组与sh-NC组相比没有明显差异。以上结果表明，sh-SNHG16通过上调miR-520a-3p的表达量，抑制NCI-H1395细胞增殖率和对吉西他滨耐药，差异具有统计学意义。

图4 SNHG16/miR-520a-3p对NCI-H1395细胞增殖率和对吉西他滨耐药的影响

3 讨论

肺癌在所有癌症死亡因素中居首位，每年死于肺癌的人数占癌症死亡人数的18%～25%[2,10]。lncRNA是一类不编码蛋白的长链RNA，研究表明其在肿瘤的发生发展过程中起重要作用，通过多种机制调控靶基因，包括转录和转录后加工、染色质修饰和蛋白质功能，从而参与人类癌症的发生发展[8]。SNHG16属于lncRNA中小核仁RNA宿主基因家族，研究表明其表达量与肿瘤分期分型、患者预后及生存率有关[6,8,11]。SNHG16在卵巢癌中高表达，与卵巢癌分期、远处转移和预后不良有关，SNHG16能够激活AKT磷酸化，上调MMP9的表达，促进卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移[12]。沉默SNHG16促进细胞周期停滞和凋亡，抑制膀胱癌细胞的增殖[8]。SNHG16在乳腺癌组织中的表达水平高于相应的非癌组织，其通过竞争性结合miR-98诱导乳腺癌细胞迁移[13]。SNHG16在宫颈癌中作为癌基因，可通过作为内源性“海绵”来调节miR-216a-5p/ZEB1，从而促进肿瘤的进展[14]。SNHG16在结直肠癌中表达显著上调，其表达与Wnt调控的转录因子ASCL2、ETS2和cMyc的表达呈正相关，敲低Wnt信号可降低SNHG16的表达，表明SNHG16受Wnt信号通路调控[7]。SNHG16过表达能够抑制肝癌细胞增殖、5-氟尿嘧啶耐药和体内肿瘤生长。

本研究主要探讨肺癌中SNHG16的表达量对化疗耐药影响的作用机制。前期研究结果表明，SNHG16在肺癌中的表达量明显高于癌旁组织，其在肺癌细胞系中的表达量也明显高于正常肺上皮细胞。我们在肺癌细胞系中敲低SNHG16的表达，降低了细胞增殖和对化疗药物吉西他滨的耐药，提示SNHG16可能在肺癌中作为癌基因促进癌细胞的增殖和对化疗的耐药。

为进一步探究SNHG16调控肺癌细胞增殖和耐药的作用机制，我们通过软件预测SNHG16作为海绵拮抗miR-520a-3p的表达，其在肺癌中的表达与SNHG16呈负相关，并采用萤光素酶报告基因实验验证了该结果，证实SNHG16靶向作用miR-520a-3p。在肺癌细胞中，同时敲低SNHG16和miR-520a-3p的表达，可降低细胞增殖和对化疗药物吉西他滨耐药的影响结果。此外，敲低SNHG16明显增加miR-520a-3p的表达量，说明敲低SNHG16抑制肺癌细胞增殖和化疗耐药通过增加miR-520a-3p的表达量实现。研究发现，miR-520a-3p在非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）中表达下调，miRNA-520a-3p通过靶向HOXD8抑制NSCLC细胞的增殖和肿瘤干细胞表型，逆转吉非替尼耐药性[15]。lncRNA能够靶向miRNA，影响miRNA生物功能，如LINC01116通过靶向miR-520a-3p上调骨肉瘤中IL-6R的表达，激活JAK-STAT信号通路，促进骨肉瘤进展[16]。

综上，SNHG16在肺癌组织和细胞中高表达，并通过“海绵”作用抑制miR-520a-3p的表达，从而促进肺癌细胞增殖和耐药。但是，目前尚不清楚SNHG16调控肺癌增殖和化疗耐药的具体作用机制，须进一步探讨。SNHG16可以作为肺癌治疗的潜在作用靶点。