原发性干燥综合征患者血清高密度脂蛋白水平及与炎症的相关性分析

杨雪君，王森，潘婕，徐志晔

南京大学医学院附属鼓楼医院 检验科，江苏 南京 210008

原发性干燥综合征（primary Sjogren's syndrome，pSS）是一种主要累及外分泌腺的慢性炎症性自身免疫病[1]，多发于老年人群，女性多见，男女比例约为1∶9～1∶20。pSS的病因及发病机制有多种理论，可能与遗传因素及免疫细胞功能异常相关，但具体的机制仍未完全明确[2-4]。pSS患者体内多种免疫细胞功能异常导致一些细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-17等异常表达，这些细胞因子的异常表达及调节紊乱在干燥综合征的发病和进展中具有重要作用[5]。高密度脂蛋白（highdensity lipoprotein，HDL）可以逆向转运胆固醇，具有抗动脉粥样硬化的作用，以往的研究多集中于HDL在动脉粥样硬化进展中的效力，但近年来的研究表明HDL还具有重要的免疫调节及抗炎作用[6-9]。HDL在自身免疫性疾病特别是pSS中的表达水平及与炎症的关系尚未见明确报道。在此，我们将回顾性分析HDL在pSS患者血清中的表达水平，并通过相关实验研究其与炎症的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2019年1～12月在我院风湿免疫科住院的350例pSS患者的临床数据，其中男性28例，女性322例，平均年龄52.7岁，pSS的诊断符合2016年美国欧洲风湿病联盟制定的分类诊断标准[10]。对照组为健康体检者共350例，男性30例，女性320例，平均年龄51.6岁。患者组与健康对照组性别年龄间无统计学差异。另外收集30例干燥综合征患者及30例年龄性别匹配的健康体检者外周血血清，以检测血清中的细胞因子水平及HDL水平。

1.2 材料

HDL及低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）（ProSpec公司）；脂多糖（LPS）（Sigma公司）；淋巴细胞分离液（国药集团化学试剂有限公司）；RPIM1640细胞培养液（Thermo Fisher公司）；TNF-α、IL-6 ELISA检测试剂盒（BD公司）；酶标仪（Bio-Rad公司）；临床生化指标检测全自动生化仪（Beckman公司）。

1.3 标本收集及检测

30例pSS患者与30例健康对照分别空腹抽取5 mL静脉血于含有分离胶和促凝剂的采血管，离心后取上清置于-80℃冻存，待标本收集完成后统一检测HDL及细胞因子水平。

1.4 外周血单个核细胞（PBMC）的分离及培养

收集正常人新鲜外周血5 mL于EDTA抗凝管中，2000 r/min离心10 min，吸出上层血浆，剩余细胞加入等体积的PBS，混匀；准备2支15 mL的离心管，每管加入3 mL Ficoll，将混匀的细胞沿倾斜的管壁缓慢加入离心管中，配平后用水平转子2300 r/min离心20 min，并设置离心机降速为最低；取出离心好的细胞，小心吸出血浆层与红细胞层之间的细胞，加入5 mL PBS，1500 r/min离心5 min，去除上清后再次用PBS洗涤1次，弃上清，振荡混匀细胞后加入2 mL RPMI1640培养液，重悬细胞并计数，调整细胞浓度为1×106/mL，铺于24孔细胞培养板培养。

1.5 ELISA检测细胞因子水平

配置含NaHCO3及Na2CO3的包被缓冲液，每个样本用双复空检测，计算所需孔数，用包被缓冲液按1∶250的比例稀释TNF-α及IL-6的包被抗体，按每孔100 μL加入新的包被板中，4℃孵育过夜；弃去包被液，每孔加入300 μL PBST洗涤3次，彻底去除孔中残留液体；每孔加入200 μL含10%胎牛血清（FBS）的PBS液，室温封闭1 h；按说明书要求稀释标准品，并将样本取出稀释至1/2；每孔加入100 μL样本、标准品或阴性对照；封板纸封闭板条，室温孵育2 h；用样本稀释液按1∶250的比例稀释二抗及辣根过氧化物酶（HRP）；弃去板孔中的样本及标准品后用PBST洗涤板条5次，最后一次彻底去除板中残留液体；每孔加入100 μL二抗及HRP混合液，封板并室温孵育1 h；去除板中液体，再次用PBST洗涤5次；每孔加入100 μL显色液，室温避光孵育15 min，观察显色情况；每孔加入100 μL终止液终止反应；放入酶标仪，读取D450nm值。

1.6 统计学分析

计量资料用x±s表示，患者组与对照组之间差异比较用Student'st检验。当P＜0.05时为差异有统计学意义，图中用“*”标示，P＜0.01图中用“**”标示。各指标的相关性研究采用Pearson相关性分析，统计学分析及做图用GraphPad Prism 5软件完成。

2 结果

2.1 pSS患者组与健康对照组血脂水平的比较

分析了pSS患者组及健康对照组之间血清中血脂指标的差异。如表1所示，pSS患者组HDL、LDL、ApoAI及胆固醇水平均显著低于健康对照组（P＜0.0001），而载脂蛋白B（ApoB）及甘油三酯在2组间无明显差异。

2.2 pSS患者血清HDL水平与炎症免疫指标的相关性分析

分析了患者血清中HDL的水平与炎症指标［红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）］及免疫指标（IgG、IgA、IgM、IgE）之间的相关性。如表2所示，HDL水平与 ESR（r=-0.38，P＜0.0001）及IgG（r=-0.35，P＜0.0001）之间有显著的相关性，而LDL水平与各炎症指标及免疫指标均无明显的相关性（表3）。

表1 pSS患者与健康对照者血脂水平比较

表2 pSS患者血清HDL水平与炎症免疫指标相关性分析

表3 pSS患者血清LDL水平与炎症免疫指标相关性分析

2.3 pSS患者血清HDL水平与炎症细胞因子间的相关性分析

为了进一步研究pSS患者血清HDL水平与炎症间的相关性，收集了30例pSS患者及30健康对照者血清，检测血清中细胞因子IL-6及TNF-α的水平。如图1A、C，pSS患者组的IL-6及TNF-α水平显著高于对照组。分析pSS患者血清HDL水平及与细胞因子的相关性发现，HDL水平与IL-6及TNF-α的水平呈显著的负相关（图1B、D）。

2.4 HDL抑制PBMC中炎性细胞因子的产生

以上研究表明pSS患者血清HDL含量降低，并且HDL含量与炎症指标及炎性细胞因子呈负相关。为了进一步证明HDL的抗炎作用，用纯化的HDL及LDL预处理正常人PBMC 24 h，用LPS刺激细胞24 h，收集细胞培养上清，检测TNF-α及IL-6的水平，发现HDL能以剂量依赖方式抑制TNF-α及IL-6的产生，而LDL无抑制作用（图2）。

3 讨论

pSS是一种慢性炎症性的自身免疫性疾病，主要侵犯泪腺、唾液腺等外分泌腺，全身其他脏器也可受累。pSS患者血清中可检测到多种自身抗体，同时患者外周血及受累器官局部炎性细胞因子水平也显著升高。HDL因具有逆向转运胆固醇的作用，所以在心血管疾病中具有保护作用，以往的研究关注HDL在心血管疾病中的作用，近年研究发现HDL具有抗炎作用，但在具体的疾病中HDL是否具有抗炎作用仍鲜有报道。本项研究发现pSS患者血清中的HDL水平显著低于健康对照，并且pSS患者的HDL水平与ESR、IgG呈显著负相关，与患者血清中细胞因子TNF-α、IL-6也具有显著的负相关。表明pSS患者血清中HDL降低，并且与pSS患者的炎症水平相关。

图1 pSS患者血清HDL水平与细胞因子间的相关性分析

图2 HDL抑制PBMC中细胞因子的产生

本研究检测了pSS患者组及正常对照组间各血脂指标的含量，其中pSS患者组HDL、LDL、ApoAI、胆固醇的含量都显著低于健康对照组。ESR和CRP是常见的反映自身免疫病活动性及炎症水平的指标，IgG在干燥综合征患者中普遍升高并与活动性相关，本研究发现HDL与ESR及IgG具有显著负相关，表明HDL可能与pSS患者的炎症及活动性相关。ESR和CRP均是非特异性的炎症指标，为了进一步探讨HDL与炎症的相关性，我们还检测了常见的炎性细胞因子水平，发现pSS患者血清中TNF-α及IL-6水平显著高于健康对照，并且HDL与TNF-α及IL-6呈显著的负相关，进一步表明在pSS患者中，HDL可能起到对抗炎症的作用。

HDL除具有抗氧化、逆向转运胆固醇的作用外，还具有抑制炎症的作用。Lee等的研究表明HDL可通过使小窝蛋白caveolin-1重新分布，从而抑制巨噬细胞向促炎性M1型巨噬细胞分化，进而抑制ERK1/2及STAT3的激活并抑制TNF-α、IL-6和MCP-1等炎性细胞因子的产生[11]。De Nardo等的研究表明HDL及ApoAI可以显著抑制Toll样受体（TLR）介导的细胞因子产生，进一步的机制研究表明HDL是通过上调转录因子ATF3的表达进而抑制TLR介导的信号通路[12]。另有研究表明重组HDL可在树突状细胞（DC）中抑制PHA 诱导的 IL-6、IL-1β、IFN-α等细胞因子及CCL-2、CCL-4等趋化因子的产生，HDL也可显著抑制TLR-2及TLR-4介导的DC的成熟[13]。这些研究表明HDL可抑制多种免疫细胞的激活，对天然免疫及适应性免疫都具有调节作用。在自身免疫性疾病中，有研究检测了血清HDL水平降低，并认为这和自身免疫性疾病患者易发心血管疾病相关[14-15]。但HDL含量与患者炎症水平之间的关系尚未见明确报道。本项研究表明干燥综合征患者血清中HDL含量降低，并与炎症水平负相关，细胞学实验证明重组HDL可抑制炎性细胞因子的产生，表明在干燥综合征中HDL同样发挥着对抗炎症的作用。pSS患者体内HDL水平降低的机制目前并不明确，有研究认为自身免疫性疾病患者体内可能存在抗HDL及抗ApoAI的自身抗体，而这些因素导致的HDL含量降低影响并阻碍HDL抗炎作用的有效发挥，这可能进一步又引起了患者体内出现过度炎症。

综上所述，本研究表明pSS患者血清中HDL、LDL的表达显著低于健康对照，HDL水平与ESR和IgG，以及炎性细胞因子TNF-α和IL-6呈显著负相关，细胞实验证明HDL可显著抑制LPS诱导的TNF-α及IL-6产生，表明在pSS中HDL与炎症水平相关，并可能发挥抗炎作用。本研究提示重组HDL或升高HDL药物有望抑制pSS患者的炎症状态，缓解并改善pSS患者的症状。