冬小麦免耕覆盖与生物有机肥施用对土壤细菌群落的影响

王小玲,马 琨,伏云珍,安嫄嫄,汪志琴,

1 宁夏大学西北土地退化与生态恢复国家重点实验室培育基地,银川 750021 2 宁夏大学农学院,银川 750021 3 中国科学院生态环境研究中心,北京 100085

免耕是指不翻耕和扰动土壤,把作物直接播种到种床上,将前茬作物残茬或草皮等覆盖地表,仅播种一次田间作业的农作制度[1]。可以减少水土流失,稳定土壤结构[2-3],形成合理的土壤水、气、热三相比；在改善土壤微生态环境,促进土壤养分良性循环中起主要贡献[4]。

土壤微生物是生态系统的重要组成部分,能够参与土壤养分循环,分解等过程,对温室气体产生和环境污染物净化起着重要作用[5]。近年来,大量研究证实,土壤微生物的数量、群落结构及多样性是维持土壤健康和质量的重要因素[6]。因此,研究不同耕作措施下土壤微生物群落结构的演替规律,对选择合理的种植措施和改善土壤生态功能具有重要意义。

目前关于不同农业管理措施下,土壤微生物群落结构及多样性变化的研究结果仍存在差异[1,3]。如长期免耕或绿肥翻压会增加土壤微生物数量,影响其多样性[7]；保护性耕作施生物有机肥也能够提高土壤细菌多样性和生物量[8]。但,传统耕作施化肥和有机肥却对土壤细菌数量和群落结构的影响较小[9]。Yang等[10]研究结果显示,免耕和秸秆还田能够增加土壤有机碳含量,调控土壤微生物生长及群落结构多样性,在提升土壤肥力和生产力方面有重要作用。

然而,以往研究更多关注的是耕作方式及施肥种类的差异对土壤生物生物量、酶活性和微生物呼吸作用等方面的影响,而同时采用免耕、覆盖和生物有机肥施用等栽培管理措施对土壤细菌群落结构影响的研究鲜有报道。因此,本研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术,对宁夏南部山区冬小麦连续3年免耕体系下土壤细菌群落群落结构组成和多样性分布特征进行系统分析,探讨不同处理措施下土壤细菌群落结构差异,明确耕作、覆盖与施肥方式的交互作用是如何影响土壤细菌群落结构组成及其多样性？为制定合理的农作制度提供理论支撑。

1 研究区域和方法

1.1 研究区概况

研究区位于宁夏固原市隆德县沙塘镇(35°21′ N,105°48′ E),如图1所示：地处宁夏南部边陲,六盘山脉以西,属于黄土高原丘陵区。气候类型为中温带季风区半湿润向半干旱过渡性气候,年均气温6 ℃,年均降水量410 mm,年均蒸发量1370 mm。海拔1720—2942 m,地势东高西低,土壤质地主要以黑垆土为主。试验前土壤基本理化性状：有机质10.63 g/kg,全氮0.52 g/kg,碱解氮41.0 mg/kg,全磷0.65 g/kg,速效磷45.5 mg/kg,速效钾170.5 mg/kg,pH 9.0。

图1 研究区地理位置Fig.1 Location of the research area

1.2 试验设计

本试验于2015年春季开始,采用双因素随机区组设计。A因素为耕作方式：分为免耕覆盖(N)、传统耕作不覆盖(T)2个水平；B因素为施肥方式：分为施生物有机肥(F)和不施生物有机肥(C),共4个处理,即免耕覆盖+施生物有机肥(NF)、免耕覆盖+不施生物有机肥(NC)、传统耕作不覆盖+施生物有机肥(TF)和传统耕作不覆盖+不施生物有机肥(TC),每个处理4次重复,小区面积3 m×4 m,共16个小区。于2015年—2018年9月种植冬麦(Triticumaestivum)‘蓝天32号’。前茬作物为蚕豆(ViciafabaL)‘临蚕6号’。2015年冬小麦种植前将蚕豆秸秆粉碎与3000 kg/hm2脱粒的小麦颖壳均匀覆盖于免耕处理土壤表面,后续试验不再覆盖任何材料。冬小麦播种量为375 kg/hm2,每小区播种12行。施肥处理的小区仅施生物有机肥(黄腐酸≥12%,有机质≥40%,巨大芽孢杆菌+胶冻样类芽孢杆菌≥0.5亿/g,净含量40 kg/袋),施用量折合纯氮(N%)90 kg/hm2,纯磷(P2O5%)为19.67 kg/hm2、纯钾(K2O%)为18.58 kg/hm2。NF处理的小区,生物有机肥随冬小麦种子条施于播种沟内,TF处理随播前耕翻施入土壤。在返青期,将前者的田间杂草齐地表割掉,覆盖在冬小麦行间；后者杂草连根拔除,扔出田外。

1.3 样品采集

2018年7月在试验区采样,按照“S”形随机多点混合取样,采集耕层0—20 cm土壤样品,每个小区随机采集5个样点混匀为1份,共获得16份样品。样品采集后去除新鲜土样中可见植物残体及土壤动物,按四分法取1 kg土样放入采样袋中,冰盒带回实验室。一部分自然风干后用于测定土壤养分；另一部分保存在-80冰箱,用于土壤细菌多样性测定。

1.4 试验方法

1.4.1土壤理化性质测定

土壤含水量采用烘干法,土壤pH值采用PHSJ-4F pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)测定(土水比1:5)；土壤全碳(TC)和总氮(TN)采用碳氮分析仪(Elementar Vario MAX)测定；土壤微生物生物量碳(SMBC)采用氯仿熏蒸—0.5 mol/L K2SO4提取；土壤全磷(TP)和速效磷(AP)采用钼锑抗比色法；碱解氮(AN)采用碱解扩散法；速效钾(AK)采用NH4OAc浸提-火焰光度法[11]。

1.4.2DNA提取和高通量测序

采用Fast DNA SPIN kits试剂盒(MP Biomedicals,USA),按照说明书进行土壤微生物总DNA提取,提取后使用Nanodrop 2000进行DNA浓度和纯度的测定,并用0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。最后利用细菌16S rDNA基因的V3+V4区域进行扩增,引物序列为515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。采用50 μl扩增体系,反应程序为：98 ℃ 预变性2 min,98 ℃变性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃ 延长30 s,72 ℃终延伸5 min,10 ℃持续25—30个循环。PCR结束后,引入Illumina MiSeq 桥式PCR兼容引物进行第二轮扩增,使用PicoGreen dsDNA Kit 分析试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)对回收的DNA精确定量[12],最后将PCR产物委托上海派森诺生物科技股份有限公司进行Illumina MiSeq 测序。

1.4.3统计分析

高通量测序数据利用QIIME(Quantitative Insights Into Microbial Ecology, v1.8.)和R(v3.2.0)软件,调用USEARCH序列比对工具,对优质序列按97%相似度水平的OTUs(Operational Taxonomic Units)进行分类学分析。采用Mothur软件对全部有效序列进行OTU聚类统计,绘制韦恩图(Venn图)。根据物种分类信息绘制物种丰度热图。利用Mothur软件[13-14]计算多样性指数(Simpson、Shannon、Chao1和ACE)。通过UniFrac软件进行NMDS分析,绘制样本聚类树[15]。采用DPS(7.05)软件对土壤理化性质、作物产量等数据进行方差分析(Duncan′s法多重比较法,显著水平设为0.05)。土壤微生物主成分分析(PCA)在多元统计分析软件Canoco 5.0中进行。Origin 8.0绘制降雨量点线图。

2 结果与分析

2.1 土壤理化性质分析

不同处理土壤理化性质如表1所示。土壤含水量、速效钾、碱解氮、总碳和总氮含量整体表现为免耕覆盖处理明显高于传统耕作处理,而土壤pH、C/N比则表现为传统耕作处理显著高于免耕处理。方差统计分析显示,与不施用生物有机肥处理相比,施用生物有机肥影响了不同处理间的土壤理化性质,但差异不显著；而耕作措施却显著改变了不同处理间土壤pH、C/N比、全氮含量(F=6.565,P=0.031*；F= 49.391,P=0.0001**；F=19.871,P=0.002**)。同时,不施用生物有机肥时,土壤pH、AP、C/N 比和SMBC 表现为TC>NC,其余土壤理化性状在各处理间均呈现NC>TC,其中SMBC和TN含量分别增加了94.04%和15.38%。施用生物有机肥时,SMBC、AP、AN、TC和TN含量均呈现NF>TF；尤以SMBC和AP含量增加幅度最大,分别为114.74%和21.87%；而C/N比和AK的含量与之相反,分别降低了5.60%和7.04%。

表1 不同处理土壤理化及生物学性状分析Table 1 Analysis of physical and chemical and biological characteristics of soil under different treatments

2.2 细菌群落结构多样性及测序数据分析

通过对土壤DNA基因组序列分析发现(表2),4种处理总共获得785688条有效序列,其中TC、TF、NC和NF处理分别获得细菌16S rRNA的平均序列数48607、48101、52687、47028条。对测序获得的序列采取随机抽样方法,并基于每个深度下抽取到的序列数及对应的OTU数绘制Specaccum物种累积曲线(图2),结果表明,土壤样品的Specaccum物种累积曲线在样本数大于10时渐渐趋于平缓,说明不同处理土壤所测的序列库容能够较好反映土壤细菌群落的物种数量,故测序数据基本合理。

图2 物种累积曲线图Fig.2 Species accumulation curve of different soil samples

表2 土壤细菌测序数据及多样性指数分析Table 2 Sequencing data and diversity index analysis of soil bacteria

2.3 细菌OTU统计及多样性分析

Venn图能够直观反映不同处理间土壤细菌群落OTUs 组成的差异性及重叠关系[16]。由图3可知,OTU水平上,TC、TF、NC和NF 4个处理中的OTU数分别为6252、5827、5867个和5936个,其中共有OTU数为3166个,特异性OTU数分别为802、568、573个和621个,表现为TC>TF>NC>和TF,且共有OTU数(3166) 是4种处理中特异性细菌OTU数的4—6倍。此外,各处理特异性OTU数以TC最大,NF次之；相比NC处理,NF中的OTU数呈现增加趋势；相比TC,TF中OTU数呈降低趋势,这说明传统耕作不覆盖施用生物有机肥处理(TF)对土壤细菌群落OTU可能会产生抑制作用,而免耕覆盖施生物有机肥处理(NF)在一定程度上则起到促进作用。

图3 OTUs分布的维恩图 Fig.3 OTUs Venn distribution diagram of soil bacterial communities TF: 传统耕作不覆盖施生物有机肥Conventional tillage without mulching, and bioorganic fertilizer; TC：传统耕作不覆盖不施生物有机肥Conventional tillage without mulching, and no bioorganic fertilizer; NF: 免耕覆盖施生物有机肥No-tillage, mulching and bioorganic fertilizer; NC: 免耕覆盖不施生物有机肥No-tillage, mulching no bioorganic fertilizer

通过分析土壤样品,计算得到土壤细菌Alpha多样性指数(表2)。结果显示,不同处理下ACE指数为4092.07—4579.71,Chao1指数为3627.36—4209.83,香浓指数为10.42—10.55,辛普森指数为0.997—0.998。当耕作覆盖和施用生物有机肥两因素交互作用时,土壤细菌丰富度指数(ACE和Chao指数)表现为TC>NF>NC>TF；而多样性指数(Simpson和Shannon指数)却呈相反趋势,表现为：NF>NC>TC>TF。与TF处理相比,NF处理中,shannon指数和Chao指数分别增加了12.5%和7.95%。而Simpson 指数降低了2.73%。整体上,传统耕作在一定程度上增加了土壤细菌群落的多样性指数,降低了丰富度指数。

2.4 细菌门水平相对丰度

通过对高通量测序结果进行分析,从4个处理中获得土壤细菌菌群分属于27门、86纲、125目、213科和315属。在门水平上,共获得34个类群(包括未鉴定类群和其他)。将相对丰度< 1%的类群归为其他,得到20个类群(图4)。其中放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和酸杆菌门(Acidobacteri)为优势菌门(相对丰度≥1%),其相对丰度分别为26.90%、26.20%、15.80%和13.50%。而芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospira)、浮霉菌门(Planctomycetes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)等是非优势菌门(相对丰度≤1%)。由图4可知,耕作和施肥两因素均对土壤细菌门水平相对丰度产生了影响,其中绿弯菌门和酸杆菌门的相对丰度在不施用生物有机肥处理中均表现为NC>TC；而施用生物有机肥时,绿弯菌门的相对丰度呈现NF

图4 门水平上土壤细菌群落结构组成Fig.4 The composition of soil bacterial community at phylum level

通过热图的颜色变化梯度和相似性能够验证物种群落组成的差异性和相似性。从土壤细菌的前50个属的热图分析发现(图5)。4种处理中的细菌群落结构均发生了显著变化。其中TF处理中,绿弯菌门的玫瑰弯菌属(Roseiflexus)的相对丰度较高；NF处理下放线菌门中的类诺卡氏菌属(Nocardioides)和土壤红杆菌属(Solirubrobacter)为优势菌属；TC处理的变形菌门中(Proteobacteria)的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Nordella属、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium),酸杆菌门中的芽孢杆菌属(Blastocatella)具有较其他处理更高的丰度分布特征；NC处理中Haliangium属和拟孢囊菌属(Kibdelosporangium)占据较高丰度。此外,TF和NF、TC和NC聚为一类,说明在免耕和施用生物有机肥的交互作用下,主要以是否施用生物有机肥为主导因素。

图5 各处理土壤优势细菌在属水平的群落热图分析Fig.5 Heat map analysis of the main bacteria at the genus level in each treatment soilAcidobacteria: 酸杆菌门;Actinobacteria： 放线菌门; Gemmatimonadetes: 芽单胞菌门; Chloroflexi: 绿弯菌门; Proteobacteria: 变形菌门; Nordella属; 鞘氨醇单胞菌: Sphingomonas; 慢生根瘤菌: Bradyrhizobium; 芽孢杆菌属: Blastocatella; 硝化螺菌属: Nitrospira; H16; Bryobacter; Acidibacter属; 芽单胞菌属: Gemmatimonas; RB41; Aeromicroiumshu属; Stenotrophobacter; Variibacter; CL500-29_marine; OM27_clade; 红游动菌属: Rhodoplanes; Ilumatobacter属; Gaiella属; Actinophytocola属; 未鉴定的放线菌属: Actinobacteria_unidentified; 红色杆菌属: Rubrobacter; 玫瑰弯菌属: Roseiflexus; 假节杆菌属: Pseudarthrobacter; 土微菌属: Pedomicrobium; Kibdelosporangium; Haliangium; 韩国生工菌属: Kribbella; 未鉴定的酸杆菌属: Acidobacteria_unidentified; 指孢囊菌属: Dactylosporangium; 伦茨氏菌属: Lentzea; 游动放线菌属: Actinoplanes; Virgisporangium; 壤霉菌属: Agromyces; 芽球菌属: Blastococcus; 地嗜皮菌属: Geodermatophilus; Skermanella; Candidatus_Alysiosphaera属; 假诺卡氏菌属: Pseudonocar Haliangiumdia; 链霉菌属: Streptomyces; 小单孢菌属: Micromonospora; 分枝杆菌属: Mycobacterium; Iamia 属; Parviterribacter; 土壤红杆菌属: Solirubrobacter; 类诺卡氏菌属: Nocardioides; Devosia; Microvirga属; 纤维菌属: Cellulomonas

2.4.1细菌门水平相对丰度差异性分析

不同处理中土壤细菌群落在门水平上的相对丰度差异性分析结果表明(图6)。土壤细菌中的酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、装甲菌门(Armatimonadetes)和螺旋体菌门(Saccharibacteria)的相对丰度在TF与NC处理间有显著差异(P=0.046、P=0.018、P=0.013和P=0.016)；放线菌门(Actinobacteria)、装甲菌门(Armatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度在NF与NC处理间也有显著差异(P=0.042、P=0.023、P=0.032和P=0.040)。当耕作和施用生物有机肥两因子交互时,硝化螺旋菌门(Nitrospirae)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)的相对丰度在TF和NF中均达到显著水平(P=0.0212)；而变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度在TF与TC处理间有显著差异(P=0.026)。此外,芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)在NF与NC之间也达到极显著水平(P=0.005)。由此说明,施用生物有机肥会显著影响土壤细菌群落结构在门水平上差异。

图6 不同处理土壤细菌群落组成在门水平的差异分析Fig.6 The differential analysis of soil bacterial community of soil samples of the different treatments based on the phylum level

2.4.2不同处理下土壤细菌群落结构与环境因子的关系

基于R软件,采用非度量多维尺度分析(NMDS,Nonmetric multidimensional scale analysis)来反映土壤细菌群落的β多样性(Stress=0.106)。如图7显示,不同处理对土壤细菌群落β多样性产生了明显影响,且形成了不同的群落空间分布结构。在不施用生物有机肥处理时,TC和NC处理的细菌群落在空间分布上相对较集中；但当施入生物有机肥后,TC和TF、NC和NF处理却出现明显分离,差异较大。

图7 不同处理土壤细菌非度量多维尺度分析(NMDS)分布 Fig.7 The distribution of soil bacteria in different treatments was analyzed on a nonmetric multidimensional scaleTF: 传统耕作不覆盖施生物有机肥Conventional tillage without mulching, and bioorganic fertilizer; TC：传统耕作不覆盖不施生物有机肥Conventional tillage without mulching, and no bioorganic fertilizer; NF: 免耕覆盖施生物有机肥No-tillage, mulching and bioorganic fertilizer; NC: 免耕覆盖不施生物有机肥No-tillage, mulching no bioorganic fertilizer

利用主成分分析发现(图8a),土壤细菌的丰富度指数(ACE和Chao1指数)和多样性指数(Simpson和Shannon指数)与土壤pH、速效磷和C/N比成正相关,与土壤全氮、碱解氮、含水量、有机碳和微生物生物量碳成负相关。对细菌群落分布的共同解释为88.57%。其中在门水平分类学组成中,放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)的相对丰度均与土壤含水量、碱解氮、有机碳、微生物生物量碳成正相关,与土壤pH、速效钾呈负相关(图8b)；拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度与土壤速效钾和全磷成正相关,与微生物生物量碳、C/N比和有机碳含量均呈负相关。芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和酸杆菌门(Acidobacteria)与土壤速效钾、C/N比呈正相关；其中非优势门浮霉菌门(Planctomycetes)与土壤C/N、pH和碱解氮成正相关,与土壤速效钾、含水量成负相关。主成分1和主成分2分别占85.68%和9.37%,两个排序轴累计变量能在95.05%上解释细菌群落结构组成的差异性。另外,细菌门水平分类学组成与第一、二排序轴之间的相关性较高,其中pH和土壤微生物生物量碳(SMBC)分别是酸杆菌门和放线菌门的主要驱动因子。

图8 细菌多样性指数及门水平类群分布与土壤理化性状间的多元分析(PCA)Fig.8 Multivariate analysis of bacterial diversity index, the distributionof soil bacterial communities based on the phylum level between soil physical and chemical characteristicsActino: Actinobacteria 放线菌门；Proteo: Proteobacteria 变形菌门；Chloro: Chloroflexi 绿弯菌门；Acido: Acidobacteria 酸杆菌门；Gemm: Gemmatimonadetes 芽单胞菌门；Nitro: Nitrospirae 硝化螺旋菌门；Plancto: Planctomycetes 浮霉菌门；Bactero: Bacteroidetes 拟杆菌门；pH、TN、TP、AP、AN、AK和TOC、SWC、C/N ration、SMBC分别指土壤pH、全氮、全磷、速效磷、碱解氮、速效钾和有机碳、土壤含水量、碳氮比、土壤微生物生物量碳；Chao1、ACE、Shannon、Simpson分别指Chao1指数、ACE指数、香浓指数和辛普森指数;图中各形状代表不同处理;NC(1—4)表示免耕、覆盖和不施生物有机肥的4个重复; NF(1—4)表示免耕、覆盖和施生物有机肥的4个重复;TC(1—4)表示传统耕作、不覆盖和不施肥的四个重复;TF(1—4)表示传统耕作不覆盖和施生物有机肥的四个重复

2.5 不同处理对冬小麦产量的影响

由表3可知,冬小麦的产量在4种处理中均有明显差异。2016年表现为NF>TF>TC>NC。在传统耕作不覆盖和免耕覆盖两种处理中,以施用生物有机肥处理最明显。其中NF处理冬小麦产量最高达到3031.25 kg/hm2。而2017和2018年,传统耕作措施下,相比不施用生物有机肥处理,施用生物有机肥处理显著增加了冬小麦产量(P<0.05),以2018年冬小麦产量增加最显著,达到22.25%。在综合因素影响下,尤以传统耕作施用生物有机肥处理效果最佳。随种植时间延长,无论是否施用生物有机肥,免耕覆盖处理下冬小麦产量均呈降低趋势,而传统耕作处理却呈增加趋势。分析认为这可能与当年气候条件、耕作措施和施肥因子等综合因素有关。

表3 不同处理对冬小麦产量的影响Table 3 The Effects of different treatments on yield of winter wheat

为进一步分析冬小麦产量与土壤细菌优势菌群的关系,将细菌前8门优势菌群与冬小麦产量作相关分析,结果表明(表4)：冬小麦产量与土壤细菌群落相对丰度均无相关性；而土壤硝化螺旋菌门(Nitrospirae)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)与酸杆菌门(Acidobacteria)显著正相关(P<0.05)；放线菌门(Actinobacteria)与土壤酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)均呈极显著负相关；变形菌门(Proteobacteria)与绿弯菌门(Chloroflexi)也呈极显著负相关(P<0.01),说明土壤微生物功能群落之间存在更多的竞争关系。

表4 作物产量与土壤细菌丰度Pearson相关性Table 4 Pearson correlation between crop yield and soil bacterial abundance

3 讨论

3.1 不同处理对土壤理化性质及冬小麦产量的影响

有研究证实,土地利用方式不同,会造成土壤理化性质出现差异[17]。本研究中,持续冬小麦免耕、覆盖和施用生物有机肥均能显著增加土壤养分含量,降低土壤pH,提升土壤全氮、总碳含量,这与Duineveld等[18]研究结果一致。与TC和NC处理相比,TF和NF处理均显著增加了土壤总碳和全氮含量,分析认为生物有机肥是一种腐熟的肥料,施入后能为土壤微生物提供大量的碳源[19]。且在不覆盖、不施生物有机肥处理的土壤中,作物根茬是有机质的主要来源,同时,施入生物有机肥后,因外源有机物的输入,也会导致土壤有机质积累[20]。另一方面,当免耕、覆盖与施用生物有机肥交互作用时,不但有小麦颖壳、田间生草覆盖分解后的有机物质,还有生物有机肥中的营养元素进入土壤,为作物提供养分需求。因此,在一定程度上,土壤微生物对根茬的降解速度发生改变,提高了作物根茬的残留量[21],减少了土壤有机质的氧化和矿化速度,最终提高了土壤中总碳的含量[22]。

免耕覆盖作为保护性耕作技术的关键技术措施之一,对培肥土壤、提高土壤水分利用率,保证旱区作物高产和稳产具有重要意义。有学者[23]指出,免耕和秸秆还田等保护性措施在一定程度上会影响小麦、水稻幼苗生长,降低作物产量。本研究中,第一年,冬小麦经济产量以NF处理最高,且随种植年限的增加,相比传统耕作,免耕处理产量出现大幅减产现象,尤其是2017年,差异最显著。根据当地气象资料显示(图9),2015年—2017年,研究区8—12月的总降雨量分别为191.6、128.7、252.5 mm,可判定作物播种后,2016年低降雨量导致苗期持续干旱,可能是影响2017年冬小麦产量降低的根本原因。另外,本研究中,相比传统耕作,免耕处理土壤容重上、中、下层均增加,其中以10—15 cm耕层土壤容重增加最显著,可能是引起土壤板结,造成水肥气热条件不协调,最终影响作物产量的另一因素。这与王峻等[24]的研究结果一致。此外,研究中,相比不施生物有机肥处理,两种施肥处理(NF和TF)中,2016—2018年冬小麦的产量均高于不施生物有机肥处理,这说明,施用生物有机肥,具有增产作用,其机制主要是生物有机肥中含有的芽孢杆菌,适于生活在各种环境中,耐受性和稳定性极强,能够促进土壤无效硅磷钾的转化,增加土壤硅磷钾的供给,提高作物产量的能力导致[25],其深层原因还有待进一步探究。

图9 2015—2018年研究区降雨量分布情况 Fig.9 Preipitationl distribution in the study area from 2015 to 2018

3.2 不同处理对土壤细菌Alpha多样性的影响

土壤微生物作为评价土壤的重要生物学指标,因不同的农业管理措施,其群落结构发生变化,也会影响农业生态系统的物质循环和能量转换[22]。如李雨泽等[26]研究发现,地膜覆盖土壤细菌丰富度降低,秸秆还田细菌多样性增加,而施用生物有机肥土壤细菌的多样性也随之增加[27]。本研究中,4种处理方式对土壤细菌群落多样性指数(Simpson指数)和丰富度指数(Chao1指数)均产生了不同程度的影响。TF处理土壤细菌丰富度指数(ACE指数)提高,多样性降低,而NF处理却相反。分析认为这与传统耕作措施,土壤频繁扰动促进土壤碳源和氮源的转化有关[28]。

土壤微生物多样性往往受植被类型、作物种类、土壤质地、pH、水分和通气等因素的影响[29]。相关研究发现,土壤pH和有机碳是影响不同混交林中土壤细菌多样性的主要环境因子；全氮和含水量是影响沙地土壤细菌结构和多样性的主导因子[30]。大量研究指出,土壤微生物在某种程度上,对干旱的响应较大,一定强度的干旱会提高土壤细菌群落结构多样性,适宜的土壤水分条件则能为细菌生长繁殖创造良好条件,维持细菌群落结构多样性[31-32]。这与本研究中土壤含水量与细菌多样性指数和丰富度指数成负相关性的结果相似。此外,土壤pH 的变化也是引起不同管理制度中土壤细菌群落结构变化的另一主要贡献因子[32]。

3.3 不同处理对土壤细菌群落结构组成的影响

Illumina MiSeq高通量测序技术的发展为微生物的研究提供了一个强大高效的平台,能够快速有效地分析土壤微生物的群落结构组成[33]。有学者[34]认为,土壤微生物群落结构的整体组成在不同生境中的差异可能较大,但优势菌群基本相似。在本研究中,4种处理下土壤细菌优势菌门均为放线菌门、变形菌门、绿弯菌门和酸杆菌门,相对丰度之和超过80%,但各处理中的相对丰度各有差异,这与以往的一些研究相似[35-36]。与传统耕作处理相比,免耕覆盖处理下,土壤酸杆菌门、放线菌门和变形菌门的相对丰度提高了30.17%—35.11%,这主要是是由于残茬及生草覆盖后,为微生物提生命活动提供了有机碳源,刺激了土壤微生物的活性,加快了自身的物质合成,使其丰度明显增加[37]。其中,酸杆菌门在NF处理中相对丰度最高,这可能是免耕、残茬及生草覆盖后,植物根系分泌物导致土壤pH值下降[38](表1),促进了酸杆菌门的活动。也可能是施用的生物有机肥中含有的“巨大芽孢杆菌+胶冻样类芽孢杆菌”,属于芽孢杆菌属,是一类硅酸盐阳性细菌,能为土壤补入大量的有益微生物,在作物根部形成有益菌群,抑制土壤有害及致病微生物的繁殖等,在一定程度上,可能为土壤中优势菌群的繁殖创造了有利条件[39]。

此外,本研究还发现具有降解土壤污染物功能的芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和将土壤中的亚硝酸氧化为硝酸盐的硝化螺旋菌门(Nitrospirae)的相对丰度在施入生物有机肥后分别降低了5.5%—8.6%和1.1%—2.6%,说明生物有机肥可能会抑制土壤污染物降解和氮肥力的提高[40]。另外,与其他3种处理相比,变形菌门中(Proteobacteria)能够利用苯甲酸、水杨酸等物质作为唯一碳源,降解土壤有毒物质,具有抵抗植物病原菌作用,适合生长在高度贫营养环境中的[41]鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)在传统耕作不施生物有机肥(TC)处理中相对丰度最高。

有学者研究证实,驱动土壤细菌群落结构组成发生改变的主要因子是土壤全氮含量[42]。如酸杆菌门能够降解植物残体、参与单碳因子代谢；放线菌门参与土壤碳氮循环。而在本研究中,我们发现土壤放线菌门与土壤碱解氮、全氮及土壤含水量呈正相关,且土壤含水量是影响放线菌门的主导因子。这可能与土壤细菌自身属性相关。普遍认为,变形菌门喜养分含量高的土壤；酸杆菌门喜贫瘠的土壤；而放线菌门主要存在于极度干旱的环境中[43]。综上所述,不同环境因素对微生物类群的影响不同。因此,关于免耕覆盖、施用生物有机肥等交互效应改善土壤细菌群落结构组成的内在机制尚需进一步研究。

4 结论

免耕覆盖、生物有机肥施用对土壤理化性质均产生了一定影响,显著增加了土壤总有机碳、总氮的含量，降低了土壤pH、C/N比和冬小麦的经济产量。与传统耕作相比,免耕覆盖施用生物有机肥提高了土壤细菌Simpson多样性指数,降低了Chao1丰富度指数,且耕作和施用生物有机肥两种因素均对土壤细菌群落分布产生了影响,其中放线菌门、变形菌门、绿弯菌门和酸杆菌门为优势菌群。速效钾和C/N比则是影响细菌群落组成中变形菌门和酸杆菌门相对丰度的主要驱动因子。