TPCK-胰蛋白酶酶解缢蛏工艺条件优化

张惠婷

（福建省产品质量检验研究院，福建 福州 350002）

多肽是具有特定氨基酸序列的生物活性物质[1]，其消化吸收率及营养价值均优于蛋白质或氨基酸，且其所具有的生理功能氨基酸无法比拟[2]，因此其也被称作为生物活性肽。生物活性肽的种类较多、分布较广[3]、食用安全性极高[4]，它不但能够提供机体生长发育所需的营养物质，还具有抗高血压、调节免疫、抗细菌等多种功能[5]。将大分子的蛋白质酶解成小分子的多肽，不但能够提高蛋白质的消化利用率，而且还能得到不同功能的生物活性肽。

目前，生物活性肽常用的制备方法为酶解法[6]。在选择利用酶解法制备生物活性肽时，挑选富含蛋白质的原料进行酶解十分关键。缢蛏在福建又称蛏子，其资源丰富[7]，分布广泛，富含蛋白质[8]，在生物活性肽的研究方面具有极大的潜力。以资源丰富、富含蛋白质的缢蛏为原料制备生物活性肽，不但能够充分地利用缢蛏蛋白，有效地发挥缢蛏存在的营养价值，还能够充分利用缢蛏资源，具有极大的市场发展空间。

利用酶解法制备生物活性肽时，不同种类酶的选择可以得到不同的多肽。TPCK-胰蛋白酶是一种特异性的肽链内切酶，能够专一性地切割蛋白分子中精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）位点[9]。采用具有专一性酶切位点的TPCK-胰蛋白酶对缢蛏蛋白进行酶解，可得到具有特定C末端残基的肽段。在酶解过程中对酶解工艺条件的控制，很大程度上影响酶解的效果。因此，本试验采用TPCK-胰蛋白酶对鲜缢蛏肉进行酶解，在单因素试验基础上，通过正交试验优选TPCK-胰蛋白酶的酶解工艺条件，为今后进一步研究制备缢蛏多肽提供数据参考。

1 材料与设备

1.1 材料

鲜活缢蛏：购于福建福州永辉超市；

TPCK-胰蛋白酶：购于上海国源生物技术有限公司，酶活性为1.1万U/mg（反应温度：37 ℃）；

Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准品：购于美国Sigma公司；

其他试剂均为分析纯。

1.2 设备

PB-10型pH计：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；

TGL-16C台式离心机：上海安亭科学仪器厂；

BS 224S型电子分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；

T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

2 试验方法

2.1 技术路线

鲜活缢蛏→去壳取鲜肉绞碎→酶解→灭酶→酶解液离心→取上清液→测定多肽含量

2.2 多肽提取量测定

凡具有两个直接连接的肽键都有双缩脲反应[10]。因此，本文酶解液中多肽提取量的测定方法参照文献[11,12]中的双缩脲测定法，并作适当修改。具体测定方法如下：

2.2.1 四肽（Gly-Gly-Tyr-Arg）标准曲线的制作

用5%（W/V）的三氯乙酸分别配制浓度梯度为0.0～1.0 mg/mL的四肽标准溶液，将不同浓度的四肽标准溶液与双缩脲试剂按体积比3∶2加入试管中，摇匀静置离心，取上清液测定OD值（540 nm）。

2.2.2 提取量测定

称取去壳的鲜缢蛏肉进行酶解，经灭酶、冷却后，将酶解产物全部转移至100 mL容量瓶中，定容离心获得上清液Ⅰ。取上清液Ⅰ与等体积的10%（W/V）三氯乙酸水溶液混合均匀，静置离心获得上清液Ⅱ。取上清液Ⅱ，用5%（W/V）的三氯乙酸水溶液定容于25 mL容量瓶中，获得样品溶液Ⅲ。将样品溶液Ⅲ与双缩脲试剂按体积比3∶2加入试管中，摇匀静置离心，取上清液测定OD值（540 nm）。通过所得的四肽回归方程，计算样品溶液Ⅲ中多肽的质量浓度C（mg/mL）。以下为多肽提取量的计算公式：

式中：

M表示多肽提取量，即每克新鲜缢蛏肉酶解得到的多肽毫克数，mg/g；

C为样品溶液Ⅲ中多肽的质量浓度，mg/mL；

V1为所吸取的上清液Ⅱ的体积，mL；

V2为样品溶液Ⅲ的体积，mL；

m为所称取新鲜缢蛏肉的质量，g；

2表示等体积的Ⅰ溶液与10%（W/V）的三氯乙酸水溶液混合后体积扩大的倍数。

2.3 TPCK-胰蛋白酶酶解工艺研究

2.3.1 TPCK-胰蛋白酶酶解工艺的单因素试验

准确称取一定质量新鲜的去壳缢蛏肉，以pH=7.8的缓冲溶液作为反应液，在水浴温度37 ℃条件下进行反应，分别考察酶解时间1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h、料液比1∶1.0、1∶2.0、1∶3.0、1∶4.0、1∶5.0、1∶6.0和酶添加量4500、9000、13500、18000、22500 U/g对多肽提取量的影响。按2.2.2的方法测定多肽提取量。

2.3.2 正交试验优选TPCK-胰蛋白酶的酶解工艺

在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验设计，优选TPCK-胰蛋白酶的酶解工艺，试验因素及水平见表1。

表1 TPCK-胰蛋白酶酶解正交试验因素及水平

3 结果与分析

3.1 四肽标准曲线的制作

按本文2.2.1方法，得四肽质量浓度（X）与其光密度（Y）之间的回归方程为：Y=0.1443X+0.0017，R2=0.9998，变量X的范围落在0～1 mg/mL之间。

3.2 TPCK-胰蛋白酶的酶解工艺研究及其优化

3.2.1 酶解时间对TPCK-胰蛋白酶酶解效果的影响

称取5 g新鲜去壳缢蛏肉，用pH值为7.8的缓冲溶液作为反应液，酶添加量为2250 U/g，料液比为1∶3.0，酶解温度为37℃条件下，分别酶解1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h，酶解结果如图1所示。由图1可知，酶解时间在1.0～5.0 h之间时，多肽提取量呈先上升后下降的变化趋势。当酶解时间为2.0 h左右时，多肽提取量达到单因素试验的最高水平。而当酶解时间大于5.0 h时，多肽提取量基本保持不变。这可能是由于TPCK-胰蛋白酶是一种特异性比较强的内切酶，随酶解时间的延长，酶解液中已没有适合TPCK-胰蛋白酶作用位点的肽段。因此多肽提取量最终趋于平衡不变的趋势。综上，酶解的时间选择为2.0 h左右较为适合。

3.2.2 料液比对TPCK-胰蛋白酶酶解效果的影响 称取5 g新鲜去壳的缢蛏肉，用pH值为7.8的缓冲溶液作为反应液，酶的添加量为2250 U/g，酶解温度为37 ℃条件下，分别按料液比1∶1.0、1∶2.0、1∶3.0、1∶4.0、1∶5.0、1∶6.0酶解2.0 h，酶解结果如图2所示。由图2可知，料液比从1∶1.0扩大至1∶6.0，多肽提取量呈先上升后下降的变化趋势。当料液比为1∶3.0时，多肽提取量达到单因素试验的最高水平。当料液比大于1∶3.0时，反应体系中溶液的增多，减少了TPCK-胰蛋白酶与底物蛋白碰撞接触的机会，导致多肽提取量下降。因此，料液比选取在1∶3.0左右。

3.2.3 酶添加量对TPCK-胰蛋白酶酶解效果的影响 称取5g新鲜的去壳缢蛏肉，用pH值为7.8的缓冲溶液作为反应液，酶解温度为37 ℃，料液比为1∶3.0，酶添加量为4500、9000、13500、18000、22500 U/g条件下，分别酶解2.0 h，酶解结果如图3所示。由图3可知，在一定范围内，随酶添加量的增加，多肽提取量也相应增加。当酶添加量为18000 U/g时，多肽提取量达到单因素试验的最高水平。当酶添加量大于18000 U/g时，多肽提取量反而开始降低。这可能是由于TPCK-胰蛋白酶将缢蛏蛋白反应完全后，酶解液中还有适合酶切位点的肽段，TPCK-胰蛋白酶对这些肽段进行酶解，使之降解成游离氨基酸，导致多肽提取量降低。综上，TPCK-胰蛋白酶的酶添加量选择为18000 U/g左右。

3.2.4 TPCK-胰蛋白酶酶解工艺的正交试验优化结果

通过对表2中极差R值进行比较可知，本试验的3个因素对多肽提取量影响的主次顺序为：A＞B＞C，即酶添加量的影响最大，酶解时间的影响最小。由K值比较得最优水平为：A2B3C2。

应用DPS数据处理系统对表2所得数据进行方差分析，分析的结果见表3。由表3可知，本试验所选取的3个因素对多肽提取量的影响顺序为：A＞B＞C，与表2极差分析的结果相一致。由方差分析结果可知，本试验3个因素对缢蛏多肽提取量都具有显著的影响。其中，A因素即酶的添加量的影响极显著。综合极差分析与方差分析的结果，选择A2B3C2为最优组合。

表2 TPCK-胰蛋白酶酶解正交试验结果

表3 TPCK-胰蛋白酶酶解正交试验方差分析

以优化所得的组合A2B3C2进行3组验证试验，试验结果表明，在最优组合下，缢蛏多肽的平均提取量可达（71.6±0.4）mg/g，表明该酶解工艺优化成功。

4 结论

本研究以多肽提取量为指标，在单因素试验的基础上，通过正交试验优选TPCK-胰蛋白酶酶解缢蛏的工艺条件，结果表明：

TPCK-胰蛋白酶酶解缢蛏的最佳酶解工艺为：pH=7.8、酶添加量18000 U/g、料液比（m∶V）为1∶3.5、酶解温度37 ℃、酶解时间2.0 h。在此最优酶解的工艺条件下，每克去壳鲜缢蛏肉可提取（71.6±0.4）mg多肽。在对TPCK-胰蛋白酶酶解缢蛏的工艺条件进行显著性分析时，发现酶添加量、料液比、酶解时间对TPCK-胰蛋白酶酶解缢蛏的效果都具有显著影响，因此在TPCK-胰蛋白酶酶解缢蛏的过程中，应注意酶添加量、料液比、酶解时间的控制。