背角无齿蚌过氧化氢酶基因的克隆及多溴联苯醚对其转录的影响

刘庆春，华春秀，薛士鹏，管翠翠，夏西超,,,*，代红梅，王雯，张科，姚伦广

1. 南阳医学高等专科学校基础医学部，南阳 473007 2. 南阳师范学院生命科学与技术学院，南阳 473061 3. 平顶山学院医学院，平顶山 476000

多溴联苯醚(PBDEs)是一类广泛应用于电子设备、塑料、纺织品和建筑材料中的阻燃剂，已被列入具有生态危害性的持久性有机污染物[1-2]。随其应用的不断增加，大量PBDEs随降雨进入池塘、河流和湖泊等地表水，并在环境中呈现持久性累积，且在生物体内大量蓄积，现已成为威胁淡水生物的重要有机污染物[3]。PBDEs很难被环境中微生物降解，容易在脂肪组织中累积下来，随整个食物链呈现放大效应[4]。PBDEs在生物体中能够催化活性氧(ROS)生成，干扰线粒体呼吸作用，导致ROS过量产生，三磷酸腺苷(ATP)合成减少，最终诱发细胞死亡[5]。在PBDEs家族中，PBDE-47和PBDE-209应用较为广泛，在多种食品和动物组织中被检测到[5]。

过氧化氢酶(catalase, CAT)是一种广泛存在于原核生物和真核生物体内的活性酶，CAT能够将H2O2分解为H2O和O2，而H2O2作为一种有害的活性氧造成细胞损伤和病变[6-7]。目前，CAT广泛应用于食品、环保和纺织业等，作为一种生物标记来检测污染物的含量。同时，CAT参与炎症反应、细胞增生和细胞凋亡及免疫细胞的激活等活动[6-7]。

双壳类是软体动物一个重要类群，常年栖息在海洋、河流和湖泊底部，以滤食生活为主，是检测环境污染的重要指示性生物[8-9]。背角无齿蚌(Anodontawoodiana)是双壳类软体动物主要类群之一，在农药、重金属和持久性有机污染物检测中发挥积极作用，常作为淡水污染的指示性生物[10-11]。为了更好揭示PBDEs环境毒性，保护淡水资源和淡水生物，本研究以背角无齿蚌为研究对象，克隆出AwCAT全基因序列，分析PBDE-47和PBDE-209对AwCAT时空表达的影响，为揭示PBDEs毒理效应提供理论参考。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 背角无齿蚌处理

背角无齿蚌购自南阳市水产市场，PBDE-47、PBDE-209和二甲亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)，纯度≥99.7%，购自Sigma-Aldrich公司，TRIzol试剂、M-MLV反转录酶、菌株DH5α、克隆载体pMDl9-T、连接酶、PCR产物回收纯化试剂盒和RACE试剂盒均购自TaKaRa公司。其余常规药品均为进口或国产分析纯。

背角无齿蚌(壳长(6.5±0.5) cm)处理之前，置于实验室自动水循环系统中适应养殖2周，停止进食。PBDE-47和PBDE-209溶解于DMSO中制备储备液。处理实验在长方形塑料盒(40 cm×25 cm，10 cm高)中进行，饲养采用人工模拟池塘水(每1 L去离子水中含48 mg NaHCO3、33 mg CaCl2·2H2O、60 mg MgSO4·7H2O和0.5 mg KCl)，喂食小球藻，处置温度(24±2) ℃[12]。为了确定AwCAT组织分布，对来自同一塑料盒5只动物进行解剖，取斧足、鳃、肝胰脏、闭壳肌、心脏和外套膜等组织。根据上述动物处理方法，动物分为对照组、PBDE-47处理组(6.25、12.5、25、50和100 μg·L-1)和PBDE-209处理组(10、20、40、80和160 μg·L-1)，对照组用同体积DMSO处理，水中DMSO浓度不超过3‰。分别在0、6、12、24和48 h每组中取出5只河蚌，解剖肝胰腺和鳃，液氮速冻，于-80 ℃保存。

1.2 总RNA提取和cDNA第一链的合成

总RNA提取采用TRIzol试剂，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，分光光度法测定RNA浓度，具有完整rRNA条带的RNA用于合成cDNA，用M-MLV试剂盒合成第一链cDNA，用作PCR反应模板。

1.3 背角无齿蚌AwCAT核心片段的扩增

用简并引物AwCAT1和AwCAT2分离AwCATcDNA保守区域片段，PCR产物连接至pMDT-19载体，3个样品双向测序。确定AwCAT部分cDNA序列后，根据部分cDNA序列设计的特异性引物(表1)，按照试剂盒要求，采用巢式PCR扩增AwCATcDNA 5’和3’区域序列，对3个5’RACE和3’RACE的PCR产物进行测序，拼接。

表1 实验过程中的引物Table 1 Description of the primes used in this study

1.4 序列和系统发育分析

通过GenBank数据库搜索(www. ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行BLAST程序比对，分析AwCAT序列；根据SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)预测信号肽；采用Simple Modular Architecture Research Tool(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测蛋白质结构域；使用DANMEN分析程序对AwCAT基因进行多序列比对；通过Swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)预测AwCAT的蛋白质三维结构；使用MEGA5.0软件构建系统进化树。

1.5 AwCAT mRNA水平定量检测

为了确定AwCAT转录水平，采用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒并按照要求进行定量分析。β-actin作为内参基因，根据AwCAT-F和AwCAT-R引物，用PCR仪中分离靶基因(表1)，琼脂糖凝胶电泳仅检测出一个条带，PCR产物测序，序列鉴别。筛选β-actin和AwCAT最佳扩增温度，采用两步法，使用ABI7500实时检测系统(Applied Biosystems，美国)进行实时定量PCR，构建标准曲线，通过2-△△CT分析AwCAT表达水平。

1.6 统计学处理

2 结果(Results)

2.1 背角无齿蚌AwCAT 分子结构

背角无齿蚌AwCATcDNA全长由1 784个核苷酸组成(GenBank NO, KU363383)，包含14 bp的5’非翻译区(UTR)和234 bp的3’UTR。开放阅读框由1 536 bp核苷酸组成，编码512个氨基酸的多肽链，分子量为58.05 kDa，理论等电点为7.23(图1)。终止信号(AATAAA)在3’UTR的1 743～1 748位点处。AwCAT具有CAT家族2个特征性标签序列，一个是高度保守催化位点序列(61FDRERIPERVVHAKGAGA77)和一个是血红素配体信号序列(351RLFSYSDTH358)(图1)。多序列比对结果显示，保守氨基酸His72、Asn145和Tyr355存在于AwCAT和其他CAT序列中(图2)；氨基酸序列比对结果表明，AwCAT含有NADPH结合残基(N145、H191、F195、S198、R200、Y212、K234、W300、Q302和Y355)和血红素结合残基(R69、H72、R109、N145、F150、R351、Y355和R362)(图2)。AwCAT中NFS(残基436～438)为糖基化作用位点。

图1 背角无齿蚌AwCAT 基因的cDNA序列和推导的氨基酸序列注：粗体部分为起始和终止密码；波浪线部分为终止信号“AATAAA”；下划线部分为潜在的活性位点序列(61FDRERIPERVVHAKGAGA77)和血红素配体信号序列(351RLFSYSDTH358)；灰色阴影部分为糖基化位点。Fig. 1 The nucleotide acid sequence and the deduced amino acid sequence of AwCAT in Anodonta woodianaNote: The start codon (ATG) and stop codon (TAA) are indicated in bold; putative polyadenylation signal “AATAAA” is showed with wavy line; the highly conserved catalytic site motif (61FDRERIPERVVHAKGAGA77) and proximal heme-ligand signature motif (351RLFSYSDTH358) are underlined; the potential N-glycosylation residues are marked with shadow.

图2 背角无齿蚌AwCAT与其他物种CAT序列多重比对注：高度保守的催化位点序列用单下划线标记，近端血红素配体标记序列用双下划线标记；NADPH结合位点(N145、H191、F195、S198、R200、Y212、K234、W300、Q302和Y355)用粗体标记；保守氨基酸(His72、Asn145和Tyr355)用阴影标记。Fig. 2 Multiple alignment of AwCAT in Anodonta woodiana with other CATNote: The highly conserved catalytic site motif and proximal heme-ligand signature motif are respectively marked in singe underline and double underline; the putative NADPH-binding residues (N145, H191, F195, S198, R200, Y212, K234, W300, Q302 and Y355) are marked with bold; the conserved catalytic amino residues (His72, Asn145 and Tyr355) are indicated with shadow.

AwCAT与其他物种CAT序列具有高度的相似性，包括12个β-折叠和23个α-螺旋(图3(a))。AwCAT三维结构排列和其物种CAT序列三维结构排列有很高的相似性(图3(b))。

图3 背角无齿蚌AwCAT二级和3D结构预测注：(a)AwCAT二级结构；(b)AwCAT的3D结构。Fig. 3 Predicted secondary and 3D structures of AwCAT deduced amino acidsNote: (a) the secondary structure of AwCAT; (b) the 3D structure of AwCAT.

2.2 系统发育分析

BLAST分析结果表明，AwCAT的氨基酸序列与其他物种CAT具有较高的同源性，与褶纹扇贝(Cristariaplicata)的同源性为91.99%，与加州夜蛾(Aplysiacalifornica)的同源性为73.88%，与家蚕(Bombyxmori)的同源性为66.09%，与斑马鱼(Daniorerio)的同源性为65.21%，与褐家鼠(Rattusnorvegicus)的同源性为66.98%，与人类(Homosapiens)的同源性为66.98%。系统发育分析表明，与AwCAT亲缘关系最近是淡水双壳类，其次是腹足类和海洋双壳类，最后是脊椎动物、昆虫和甲壳类动物(图4)。

图4 根据背角无齿蚌AwCAT氨基酸序列使用邻接法构建的系统进化树Fig. 4 Phylogenetic relationship of AwCAT of Anodonta woodiana according to neighborhood-joining method

2.3 AwCAT的组织分布

实时定量PCR结果显示，背角无齿蚌AwCAT在斧足、鳃、肝胰脏、闭壳肌、外套膜和心脏壳中广泛表达(图5)。AwCATmRNA在肝胰脏和鳃中表达水平最高，闭壳肌、外套膜和斧足为中等水平表达，心脏中表达水平较低(图5)。

图5 背角无齿蚌AwCAT基因的空间表达注：每组数据来源于5只动物，重复3次。Fig. 5 Real-time PCR analysis of AwCAT transcript from different tissuesNote: The data of each group were from 5 animals, and tests were repeated 3 times.

2.4 急性毒性实验

背角无齿蚌48 h急性毒性试验结果表明，PBDE-47对背角无齿蚌的半数致死浓度(LC50)为33.36 μg·L-1(表2)。最高浓度PBDE-209(160 μg·L-1)对背角无齿蚌的存活没有显著影响(表2)，因此，本实验中PBDE-209对背角无齿蚌的LC50值不能确定。

表2 PBDE-47和PBDE-209对背角无齿蚌的48 h急性毒性实验Table 2 The 48 h acute toxicity experiments for Anodonta woodiana exposed to PBDE-47 and PBDE-209

2.5 PBDE-47和PBDE-209对肝胰腺AwCAT表达的影响

在浓度为6.25、12.5、25、50和100 μg·L-1的PBDE-47处理组中，肝胰腺中AwCATmRNA水平显著增加，并且这种上调效应呈现时间和剂量依赖模式。与对照组相比，整个实验观察过程中AwCATmRNA水平在6.25、12.5、25、50和100 μg·L-1的PBDE-47处理组中分别增加了66.66%(P<0.05)、1.35倍(P<0.05)、1.54倍(P<0.05)、1.97倍(P<0.01)和2.39倍(P<0.01)以上(图6)。

图6 PBDE-47对背角无齿蚌肝胰腺AwCAT基因表达的影响注：数据表示为平均值±标准差；n=5/组/时间点；a(P<0.05)、b(P<0.01)表示与相应对照组相比有显著差异；下同。Fig. 6 Temporal expression of AwCAT in the hepatopancreas of Anodonta woodiana after PBDE-47 exposureNote: Data are represented as means±SE; n=5/each group/each time point; a (P<0.05), b (P<0.01) mean significant difference vs control group at the same time; the same below.

与对照组相比，PBDE-209处理组AwCATmRNA水平呈现增加趋势。在10、20、40、80和160 μg·L-1的处理组中，AwCAT表达水平分别增加了7.84%、35.38%、61.53%(P<0.05)、1.03倍(P<0.05)和1.09倍(P<0.05)以上(图7)。

图7 PBDE-209对背角无齿蚌肝胰腺AwCAT基因表达的影响Fig. 7 Temporal expression of AwCAT in the hepatopancreas of Anodonta woodiana after PBDE-209 exposure

2.6 PBDE-47和PBDE-209对鳃AwCAT表达的影响

与对照组相比，PBDE-47处理组鳃中AwCATmRNA水平在第6小时显著升高，随后随时间呈降低的趋势。在浓度为6.25、12.5和25 μg·L-1的PBDE-47处理组中，鳃中AwCATmRNA水平显著增加；与对照组相比，整个实验观察过程中AwCATmRNA水平在6.25、12.5和25 μg·L-1的PBDE-47处理组中分别增加了1.97倍(P<0.01)、58.68%(P<0.05)和52.77%(P<0.05)以上(图8)。50 μg·L-1和100 μg·L-1的PBDE-47处理组中，鳃中AwCATmRNA水平在第48小时低于正常水平，分别减少了24.31%和58.68%(P<0.05) (图8)。

图8 PBDE-47对背角无齿蚌鳃AwCAT基因表达的影响Fig. 8 Temporal expression of AwCAT in the gill of Anodonta woodiana after PBDE-47 exposure

与对照组相比，PBDE-209处理组鳃中AwCATmRNA水平显著增加。在10、20、40、80和160 μg·L-1的处理组中，AwCAT表达水平分别增加了85.71%(P<0.05)、1.52倍(P<0.05)、1.76倍(P<0.05)、2.02倍(P<0.01)和2.38倍(P<0.01)以上(图9)。

图9 PBDE-209对背角无齿蚌鳃AwCAT基因表达的影响Fig. 9 Temporal expression ofAwCAT in the gill of Anodonta woodiana after PBDE-209 exposure

3 讨论(Discussion )

AwCAT序列包含一个是高度保守催化位点序列(61FDRERIPERVVHAKGAGA77)和一个是血红素配体信号序列(351RLFSYSDTH358)，提示AwCAT属于CAT家族的成员。多数CAT属于单功能过氧化氢酶，是一种高度保守的含有4个同源性亚基的酶类，每个亚基能够分别结合1个血红素辅基和还原型辅酶[13-14]。血红素是一种含铁的辅基，常以铁卟啉的形式存在，是CAT分子上的主要活性位点，它不仅参与催化H2O2形成无毒的H2O和O2，还能够抑制脂质过氧化作用，保护机体免受损伤[13-14]。多序列比对结果显示，AwCAT和其他物种CAT均拥有保守的氨基酸残基，如His72、Asn145和Tyr355。AwCAT的C端过氧化物酶体靶向信号ANL与人类、小鼠和大鼠CAT典型信号一致，提示AwCAT可能与脊椎动物CAT家族大多数成员一样具有过氧化物酶体糖蛋白的功能。哺乳动物中，NADPH一般认为与CAT紧密结合，并将底物(H2O2)提供给CAT，这一过程是通过CAT表面NADPH结合位点与血红素基团之间电子通道来完成和实现的[15-16]。AwCAT序列中12个氨基酸残基与NADPH结合位点形成有关，其中，10个保守残基(N145、H191、F195、S198、R200、Y212、K234、W300、Q302和Y355)发挥关键作用。AwCAT蛋白序列二级结构和三级结构结果显示，AwCAT中α-螺旋和β-折叠数量与脊椎动物数量相同，具有共同的保守残基和空间结构，提示AwCAT这些结构特征与清除H2O2有关。

AwCAT在不同组织中具有不同的表达模式。肝胰腺中AwCATmRNA的表达水平最高，这与肝胰脏作为主要代谢场所和主要防御器官对氧化应激的作用有关。类似的结果也在凡纳滨对虾和拟穴青蟹研究中发现[12]。肝胰腺相当于哺乳动物的肝脏和昆虫的脂肪体，被认为在非特异性免疫中发挥着重要的作用。由于其具有较高的代谢活性并且机体不断产生活性氧，AwCAT基因高表达量表明它可能作为一种重要的肝胰腺解毒酶。在其他组织中AwCAT广泛分布与不同器官中H2O2的氧化应激效应有关[12]。

在选定PBDE-47实验浓度时，PBDE-47的LC50为33.36 μg·L-1，但未检测到PBDE-209的LC50，提示在相同的处理浓度下背角无齿蚌对PBDE-47胁迫效应比对PBDE-209更为敏感。48 h急性毒性试验结果表明，PBDEs对水蚤的48 h-LC50大小顺序为：PBDE-28

研究发现，PBDE-47和PBDE-209处理后背角无齿蚌肝胰腺和鳃中AwCAT表达水平显著增加，提示这与AwCAT增加机体H2O2和提高胁迫耐受性有关。白斑综合征病毒感染后，日本囊对虾肝胰腺CAT基因表达水平逐渐升高，48 h达到最高水平，以维持机体稳态和抗氧化防御能力[18]。重金属铅(Pb2+)处理后，鲫鱼血清乳酸脱氢酶和CAT活性明显升高，以增强机体对重金属的胁迫效应和抗氧化能力[19]。Pb2+处理后太平洋牡蛎消化腺、鳃和闭壳肌中CAT表达呈现诱导效应，以提升机体耐受力[20]。随着进入体内的PBDE-47和PBDE-209增多，逐渐诱导产生大量活性氧自由基，进而诱导超氧化物歧化酶活性不断攀升，导致H2O2不断升高。CAT作为H2O2浓度调节器，H2O2的升高，刺激体内CAT表达释放和水平升高，用于分解H2O2。由此可知，PBDE-47和PBDE-209处理后背角无齿蚌肝胰腺和鳃AwCAT表达水平显著增加与增强动物抗氧化能力和耐受性有关。

与对照组相比，不同浓度PBDE-47暴露后，前期AwCAT表达水平显著上调，后期出现下调现象，提示这与PBDE-47在背角无齿蚌体内累积和代谢有关。正常情况下，动物体内ROS保持相对较低的水平，ROS生成后将迅速被一系列抗氧化酶清除，以维持ROS水平与抗氧化酶活性之间的平衡[21-22]。抗氧化酶是机体内稳态的重要标志之一。鳃作为贝类重要免疫器官，鳃丝直接接触PBDE-47，并通过鳃丝呼吸作用迅速进入机体，产生大量ROS，相对与肝胰腺而言，PBDE-47对鳃氧化应激效应更为直接和明显。持续高剂量长时间的PBDE-47暴露，将会导致进入体内PBDE-47超过鳃的解毒极限，鳃会受到损伤，鳃组织中大量细胞凋亡[23]。由此，处理后期AwCAT呈现表达水平下调的现象。在PBDE-209处理组中，鳃AwCAT表达呈时间和剂量依赖效应，与所选择的PBDE-209浓度未达到临界值有关，动物在这种浓度可以产生足够的抗氧化能力，从而保持机体ROS生成和抗氧化酶还原作用之间的平衡。

由PBDE-47和PBDE-209对AwCAT时空表达诱导作用的特异性可以看出，PBDEs对背角无齿蚌胁迫是一个综合的效应，其产生氧化应激后抗氧化系统启动，经历不同的暴露剂量和时间后产生损伤或修复。与相同浓度的PBDE-209相比，PBDE-47对这些非目标生物的危害更大。

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