尿激酶联合低分子肝素对急性肺栓塞大鼠炎性反应及肺血流动力学的影响研究

孟燕，潘龙飞，马强，庞宏刚

急性肺栓塞（acute pulmonary embolism，APE）是因内源性或外源性栓子堵塞肺动脉所致的肺循环障碍，主要临床表现为呼吸困难、胸痛、咯血三联征，并可引发肺动脉高压、右心衰竭、梗阻性休克、循环衰竭甚至死亡［1］。抗凝治疗与溶栓治疗是APE患者的有效治疗方法，二者均能迅速疏通阻塞的肺血管，改善肺血流动力学，进而改善全身血流动力学状态并减轻呼吸功能障碍［2］。低分子肝素（low molecular weight heparin，LMWH）、尿激酶（urokinase，UK）是临床治疗APE的常用药物，但具体作用机制尚未完全明确［3］。研究表明，APE是一种炎症浸润性疾病，可导致肺动脉压持续升高、肺血流动力学改变［4-5］。本研究采用自体血栓栓塞法制备APE大鼠动物模型，旨在分析UK联合LMWH对其炎性因子、肺血流动力学的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2018—2019年，选取80只健康雄性SD大鼠，12周龄，体质量260～300 g，平均体质量（282.4±10.3）g，均由西安交通大学医学部动物实验中心提供，实验动物许可证号：SCXK（陕）2018-001。饲养条件：12 h/12 h明暗交替，温度20～22℃，湿度50%～60%。本实验经西安交通大学医学部生物医学伦理委员会批准（批准号：2020-238）。

1.2 主要实验设备、药物及试剂

1.2.1 主要实验设备 低温高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司生产），电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司生产），小动物心电监护仪及肺动脉漂浮导管和测压设备（成都泰盟软件有限公司生产），血气分析仪（美国Osmetech公司生产），光学显微镜（日本Olympus生产）。

1.2.2 主要药物与试剂 UK（南京南大药业有限责任公司生产，生产批号：20200204），LMWH选择依诺肝素钠注射液〔赛诺菲（北京）制药有限公司生产，生产批号：8S13N〕。白介素1β（IL-1β）、白介素8（IL-8）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）试剂盒均购自北京晶美生物工程有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组 将80只SD大鼠随机分为假手术（Sham）组、APE组、LMWH组、UK组及LMWH+UK组，每组16只。

1.3.2 模型制备 除Sham组外，其他组大鼠均采用自体血栓栓塞法制备APE大鼠动物模型，具体方法如下：取大鼠尾静脉血0.2 ml静置，70 ℃水浴10 min，制成0.6 mm×0.8 mm的自体血栓，采用0.9%氯化钠溶液洗涤，而后加入0.9%氯化钠溶液2 ml并置于4 ℃环境下备用。腹腔注射20%乌拉坦（6 ml/kg）麻醉大鼠，沿颈前正中线作一2 cm切口，钝性分离颈外静脉，插入导管并迅速注入20～30个血栓（注栓速度为0.5 ml/s）。Sham组不注入血栓栓子，仅注入等量0.9%氯化钠溶液。

1.3.3 建模成功标准 注入血栓后，可见大鼠呼吸深快，心率增加，双耳、唇发绀，偶见抽搐，双肺可闻及湿啰音；心电监护可见血氧饱和度下降；肺动脉压先升高后降低，随后再持续升高，肺动脉收缩压升高至40～60 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），且维持30 min无变化，提示APE大鼠模型制备成功［6-8］。

1.3.4 干预方法 模型制备成功后，LMWH组大鼠皮下注射依诺肝素钠注射液0.01 ml/kg，1次/12 h，用药至处死大鼠时。UK组大鼠静脉滴注UK 20 000 U/kg，维持治疗1 h［7-8］。UK+LMWH组大鼠静脉滴注UK 20 000 U/kg、维持治疗1 h；之后皮下注射依诺肝素钠注射液0.01 ml/kg，1次/12 h，用药至处死大鼠时。Sham组、APE组大鼠静脉滴注等量0.9%氯化钠溶液。术后各组大鼠均自由进食、进水，干预8、72 h后每组分别处死8只大鼠，留取血液及肺组织备用。

1.4 观察指标

1.4.1 炎性因子 分别于干预8、72 h时取大鼠血清2 ml，采用酶联免疫吸附试验检测血清炎性因子水平，包括IL-1β、IL-8、TNF-α。

1.4.2 肺血流动力学指标及血气指标 分别于干预8、72 h时腹腔注射20%乌拉坦麻醉大鼠，分离右侧颈外静脉，插入聚苯乙烯管进肺动脉、右心房、右心室，连接小动物心电监护仪，检测平均肺动脉压（mPAP）、右心室压力（RVP）；取右颈动脉血2 ml，使用血气分析仪检测动脉血氧分压（PaO2）及动脉血二氧化碳分压（PaCO2）。

1.4.3 肺组织病理学 分别于干预8、72 h时处死大鼠，取右肺组织标本，甲醛固定48 h，常规石蜡切片、HE染色，显微镜下观察各组大鼠肺组织病变情况。

1.5 统计学方法 采用SPSS 21.0统计学软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 炎性因子 干预8、72 h，各组血清IL-1β、IL-8、TNF-α水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。干预 8、72 h，APE组血清IL-1β、IL-8、TNF-α 水平高于Sham组，差异有统计学意义（P＜0.05）。干预8、72 h，LMWH组和UK组血清IL-1β、IL-8、TNF-α水平高于Sham组，但低于APE组，差异有统计学意义（P＜0.05）。干预8 h UK+LMWH组血清IL-1β水平低于APE组，差异有统计学意义（P＜0.05）；干预72 h UK+LMWH组血清IL-1β水平高于Sham组，但低于APE组，差异有统计学意义（P＜0.05）。干预8 h UK+LMWH组血清IL-8水平低于APE组和LMWH组，差异有统计学意义（P＜0.05）；干预72 h UK+LMWH组血清IL-8水平高于Sham组，但低于APE组、LMWH组、UK组，差异有统计学意义（P＜0.05）。干预8、72 h，UK+LMWH组血清TNF-α水平高于Sham组，但低于APE组、LMWH组、UK组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.2 肺血流动力学及血气指标 干预8、72 h，各组mPAP、RVP、PaO2比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；各组PaCO2比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。干预8、72 h，APE组mPAP、RVP高于Sham组，但PaO2低于Sham组，差异有统计学意义（P＜0.05）。干预8、72 h，LMWH组和UK组mPAP、RVP高于Sham组，但低于APE组，差异有统计学意义（P＜0.05）。干预8、72 h，LMWH组和UK组PaO2低于Sham组，但高于APE组，差异有统计学意义（P＜0.05）。干预8 h UK+LMWH组mPAP高于Sham组，但低于APE组和LMWH组，差异有统计学意义（P＜0.05）；干预72 h UK+LMWH组mPAP高于Sham组，但低于APE组，差异有统计学意义（P＜0.05）。UK+LMWH组干预8 h RVP低于APE组和LMWH组，干预72 h RVP低于APE组，差异有统计学意义（P＜0.05）。干预8 h UK+LMWH组PaO2低于Sham组，但高于APE组和LMWH组，差异有统计学意义（P＜0.05）；干预72 h UK+LMWH组PaO2高于APE组、LMWH组及UK组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表1 各组大鼠干预8、72 h血清炎性因子水平比较（±s，ng/L）Table 1 Comparison of serum levels of inflammatory factors in each group 8 and 72 hours after intervention

表1 各组大鼠干预8、72 h血清炎性因子水平比较（±s，ng/L）Table 1 Comparison of serum levels of inflammatory factors in each group 8 and 72 hours after intervention

注：Sham=假手术，APE=急性肺栓塞，LMWH=低分子肝素，UK=尿激酶，IL-1β=白介素1β，IL-8=白介素8，TNF-α=肿瘤坏死因子α；与Sham组比较，aP＜0.05；与APE组比较，bP＜0.05；与LMWH组比较，cP＜0.05；与UK组比较，dP＜0.05

组别 只数 IL-1β IL-8 TNF-α干预8 h 干预72 h 干预8 h 干预72 h 干预8 h 干预72 h Sham 组 8 27.21±4.41 27.04±4.39 437.92±18.64 442.25±20.79 174.30±12.00 177.92±9.75 APE 组 8 37.79±4.64a 44.71±5.05a 527.39±21.19a 646.05±17.14a 262.66±12.41a 340.29±14.41a LMWH 组 8 32.63±4.61ab 35.28±5.17ab 471.32±18.58ab 496.04±13.64ab 224.08±16.14ab 246.35±18.62ab UK 组 8 31.82±4.36ab 34.26±4.06ab 462.11±13.45ab 485.63±15.38ab 223.63±15.05ab 244.81±14.67ab UK+LMWH 组 8 28.59±4.51b 31.95±5.21ab 450.80±14.39bc 464.67±13.65abcd 193.35±15.14abcd 210.02±17.47abcd F值 6.667 14.513 31.093 194.017 44.894 126.504 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 肺组织病理学 干预8、72 h，Sham组大鼠肺组织与血管内皮细胞、管壁正常。APE组、LMWH组、UK组、UK+LMWH组大鼠肺组织均可见肺动脉栓塞。APE组大鼠肺泡可见大量渗出，肺泡间隔增厚，并伴有大量炎性细胞浸润。LMWH组、UK组、UK+LMWH组大鼠肺泡渗出、肺间质炎性细胞浸润轻于APE组。UK+LMWH组肺泡渗出、肺间质炎性细胞浸润轻于LMWH组、UK组，详见图1。

3 讨论

APE是临床常见疾病，其发病率为（100～200）/10万，病死率位居各类心血管疾病第三位［9］，其治疗原则为迅速疏通阻塞的肺血管并预防新血栓形成［10］。溶栓治疗与抗凝治疗是经循证证据证实的治疗APE的有效方法，二者能迅速溶解血栓、改善肺血流动力学、恢复肺组织灌注、降低病死率，且二者联合应用效果明显优于单纯抗凝治疗［11］，但具体作用机制尚不十分清楚。有研究表明，APE发生后局部炎性反应是导致肺动脉压持续升高及肺血流动力学障碍加重的原因之一［4-5］，因此减轻炎性反应是APE的重要治疗措施。本研究旨在探讨UK联合LMWH对APE大鼠炎性反应及肺血流动力学的影响。

图1 各组大鼠干预8、72 h肺组织病理学（HE染色，×100）Figure 1 Pathology of lung tissue in each group 8 and 72 hours after intervention

表2 各组大鼠干预8、72 h肺血流动力学及血气指标比较（±s，mm Hg）Table 2 Comparison of pulmonary hemodynamics and blood gas indexes in each group 8 and 72 hours after intervention

表2 各组大鼠干预8、72 h肺血流动力学及血气指标比较（±s，mm Hg）Table 2 Comparison of pulmonary hemodynamics and blood gas indexes in each group 8 and 72 hours after intervention

注：mPAP=平均肺动脉压，RVP=右心室压力，PaO2=动脉血氧分压，PaCO2=动脉血二氧化碳分压；与Sham组比较，aP＜0.05；与APE组比较，bP＜0.05；与LMWH组比较，cP＜0.05；与UK组比较，dP＜0.05

组别 只数 mPAP RVP PaO2 PaCO2干预8 h 干预72 h 干预8 h 干预72 h 干预8 h 干预72 h 干预8 h 干预72 h Sham 组 8 15.42±2.53 15.36±2.19 38.24±3.10 38.32±2.41 95.80±2.12 95.72±2.34 42.39±4.72 42.22±4.41 APE 组 8 30.52±3.06a 25.48±2.97a 50.94±3.00a 47.16±3.75a 75.43±3.38a 77.14±3.90a 44.76±4.24 44.38±4.74 LMWH 组 8 23.32±2.91ab 20.03±3.30ab 46.93±3.07ab 42.07±2.45ab 82.18±3.13ab 86.46±2.85ab 43.60±4.10 43.36±3.97 UK 组 8 21.40±3.24ab 19.38±3.82ab 44.77±3.03ab 41.59±2.74ab 84.84±3.40ab 88.23±3.60ab 42.46±4.11 42.55±3.97 UK+LMWH 组 8 19.37±2.46abc 18.65±3.34ab 41.46±4.08bc 40.95±3.43b 87.22±3.28abc94.85±2.46bcd 41.44±3.38 41.22±4.15 F值 30.584 10.656 17.795 9.170 46.050 47.181 0.763 0.625 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.556 0.648

本研究结果显示，干预8、72 h，APE组大鼠肺泡可见大量渗出，肺泡间隔增厚，并伴有大量炎性细胞浸润，且APE组血清IL-1β、IL-8、TNF-α水平均高于Sham组，提示APE启动了复杂的炎性反应，分析其原因可能与受损的血管内皮或肺上皮细胞激活局部炎性反应，进而导致IL-1β、IL-8、TNF-α过度释放有关；而上述炎性因子又可增加肺泡毛细血管通透性，进而影响气体交换并导致机体发生低氧血症［12-13］。本研究结果显示，干预8、72 h，LMWH组和UK组血清IL-1β、IL-8、TNF-α水平均高于Sham组，但低于APE组，提示LMWH和UK均能有效减轻APE大鼠炎性反应，分析其机制主要如下：LMWH作为肝素和凝血因子X结合的五糖衍生物，可通过抑制凝血因子X和细胞间黏附分子1、阻断T细胞趋化运动等途径而发挥抗炎作用［14］；而UK作为从健康人新鲜尿液中提取的蛋白消解酶，能直接作用于内源性纤维蛋白系统，通过催化裂解纤溶酶、降解凝血因子、解除肺动脉栓塞等途径而间接拮抗炎性因子的释放［15-16］。本研究结果还显示，干预8 h UK+LMWH组血清IL-8水平低于LMWH组，干预72 h UK+LMWH组血清IL-8水平低于LMWH组、UK组，干预8、72 h UK+LMWH组血清TNF-α低于LMWH组、UK组，提示LMWH联合UK对APE大鼠炎性反应的抑制作用优于单用LMWH及UK，分析其原因可能为UK与LMWH联用发挥协同作用，继而可更有效地抑制炎性反应，改善肺栓塞病理生理过程。

肺血流动力学障碍是APE的主要病理生理特征，可表现为肺动脉压持续升高、肺血管灌注减少和换气功能障碍等［17-18］，其中栓子堵塞是其主要原因。而LMWH除具有抗凝、阻止继发性血栓形成作用外，还能抑制内皮素1、碱性成纤维细胞生长因子mRNA表达，可修复受损的血管内皮细胞、拮抗APE后肺血管重构［7，19］。UK能直接或间接作用于纤溶酶原，降解纤维蛋白原、凝血因子，进而发挥溶栓作用；此外其还能提高血管二磷酸腺苷酶活性，抑制血小板聚集、预防血栓形成［20-21］，但其t1/2较短（20～30 min），有停药后血栓复发风险，故其与LMWH联用能增强机体纤溶酶活性、减缓血栓形成速度，进而降低肺动脉高压发生风险［22-23］。本研究结果显示，干预8、72 h，APE组mPAP、RVP高于Sham组，但PaO2低于Sham组，提示APE后机体存在肺血流动力学障碍和低氧血症，分析其原因主要为：高浓度炎性因子聚集除可加剧心肌组织损伤、诱导心肌细胞凋亡、导致心室功能损伤外，还可激活凝血系统，诱导血管损伤与血栓形成［24］，进而导致右心功能损伤及血栓性肺动脉高压［25］。本研究结果显示，干预8、72 h，LMWH组和UK组mPAP、RVP低于APE组，PaO2高于APE组，提示单用LMWH、UK可有效降低APE大鼠肺动脉压力，改善肺血流动力学、矫正低氧血症，分析其原因可能与LMWH、UK能抑制炎性反应有关。本研究结果还显示，干预8 h UK+LMWH组mPAP和RVP低于LMWH组，PaO2高于LMWH组；干预72 h UK+LMWH组PaO2高于LMWH组及UK组，提示LMWH联合UK对APE大鼠肺血流动力学及换气功能的改善效果优于单用LMWH及UK，与既往研究结果一致［26-27］。

综上所述，UK联合LMWH能有效减轻APE大鼠炎性反应，改善肺血流动力学及换气功能，且效果优于单用UK及LMWH；但本研究观察时间较短，且未进一步阐述UK联合LMWH减轻炎性反应、改善肺血流动力学的分子机制。

作者贡献：孟燕、潘龙飞进行文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析，结果的分析与解释，并进行论文的修订；孟燕、马强、庞宏刚进行数据收集、整理、分析；孟燕撰写论文，并对文章整体负责、监督管理；潘龙飞负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。