白芨多糖提取纯化新工艺的研究

雷燕妮，张小斌*， 李多伟，杨 梅，陈冬平

(1.商洛学院，陕西 商洛 726000；2.西北大学 生命科学学院，陕西 西安 710069；3.西安宇沐生物技术研究院有限公司，陕西 西安 710003；4.中郅实业(贵州)有限公司，贵州 都匀 558000)

白芨[Bletillastriates(Thuub) Reichb. f.]为兰科植物白芨的干燥块茎，有收敛、止血、清热利湿、消肿生肌之功效[1]。它的主要药用有效成分是白芨胶质。经过现代药理研究，证实了白芨胶质可以防止生成肿瘤血管，防止感染，抗肿瘤，还能加速凝血。大分子多糖是白芨胶质的主要成分，是一种中性杂多糖，而且，可以作为质量上等的天然增稠剂，它的成膜性能比聚乙烯醇和羧甲基纤维素钠都要好。白芨多糖胶和机体组织很容易融在一起，机体缓慢地将白芨多糖降解吸收，而且不具备致热原性和抗原性，因此在生物医学材料方面，白芨多糖胶有着非常大的发展前景，除此以外，在日化产品的应用中，作为化学增稠剂，白芨多糖胶完全可以替代，它对皮肤的刺激性也比较小，同时，可以延缓皮肤衰老[2～5]。笔者对白芨多糖的提取纯化进行深入研究，以期获得纯度高、色泽浅、可工业化生产的白芨多糖提取纯化新工艺，为白芨多糖产业化生产奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

紫外分光光度计(型号：UV-9000S，上海精密仪器仪表有限公司)；数显恒温水浴锅(型号：HH-4，上海力辰邦西仪器科技有限公司)；旋转蒸发器(型号：RE201，郑州市申研仪器设备有限公司)；超声萃取器(型号：HA-300，北京恒奥德仪器仪表有限公司)；循环水式多用真空泵(型号：SHZ-DIII，上海羌强实业发展有限公司)；电子天平(型号：SPS202F，梅特斯-托利称量设备系统公司)，膜分离浓缩器(型号：KRT-D-NF，合肥科锐特环保工程有限公司)。

1.2 试剂

白芨块茎由陕西洋县种植基地提供，鲜茎切片后于65℃干燥后粉碎过筛(10目)，待用。

所有化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 分析测试方法 白芨多糖含量的测定 白芨还原糖采用3, 5-二硝基水杨酸法测定，白芨总多糖采用苯酚-硫酸法测定；白芨多糖=白芨总糖-白芨还原糖，用分析纯葡萄糖为对照品(校正系数0.9)[6]。

白芨原料中总多糖含量的测定 称取白芨粉末样品5.0 g，加水100 mL，于65℃回流提取3 h，提取液中总糖含量(GT)、还原糖含量(GR)用上法测定，由下式计算出多糖含量(GP)。GP=(GT-GR)×100%

白芨多糖总提取率：

白芨多糖总提取率(%)=

2.1.2 白芨多糖单因素最佳提取条件的确定 超声波水提法：取5.00 g白芨粉末用10、15、20倍量蒸馏水超声波提取30、45、60 min，超声提取1、2、3次，超声提取温度35℃、45℃、55℃，合并滤液，滤液减压浓缩至1∶2(w∶v)，浓缩液冷却后用3倍量95%乙醇进行沉淀，离心浸出上清液，沉淀物用蒸馏水加热溶解，用100 mL容量瓶定容。

水热回流提取法：取5.00g白芨末粉用10、15、20倍量蒸馏水45℃、65℃、85℃热回流提取1、2、3 h，水热回流提取1、2、3次，合并滤液，以下同上。

2.1.3 白芨多糖正交试验确定提取的最佳条件 由2.1.2实验结果可知，水热回流提取法的提取率远不如超声波水提法的提取率，超声波水提法为白芨多糖提取的优选方法。故确定用正交试验来研究超声波水提法中提取时间、提取次数、料液比及提取温度对白芨多糖提取的影响，以确定白芨多糖超声提取的最佳提取条件。

2.1.4 白芨多糖中蛋白单因素确定最佳去除的条件 Sevag法除蛋白 取提取滤液，用浓度20%盐酸溶液或20%氢氧化钠溶液调节pH至6.5，加入中温型α-淀粉酶3‰(w∶v)于60℃水浴下水解3 h,除去提液中严重影响提取纯化的淀粉成分，滤液浓缩至1∶5(w∶v)，装入分液漏斗中，并加入0.2倍体积的氯仿及0.04倍的正丁醇。混合剧烈振荡20 min，静置分层，弃去有机溶剂、变性蛋白(下层)及少量糖液层，保留糖液层(上层)，将弃去部分离心，回收多糖液，重复除蛋白7次，用蒸馏水稀释，用100 mL容量瓶定容。

酶解法除蛋白 取提取滤液，用浓度20%盐酸溶液或20%氢氧化钠溶液调节pH至6.5，加入中温型α-淀粉酶3‰(w∶v)于60℃水浴下水解3 h,除去提液中严重影响提取纯化的淀粉成分，在调节pH至7.5，调整溶液浓度2～6 mg·100 mL-1，加入植物蛋白酶2‰～4‰(w/v)于35～55℃下搅拌酶解2～4 h，使提取液中白芨蛋白水解为白芨蛋白肽及氨基酸等，以利于与多糖的分离，粗滤，用10 000分子量超滤膜超滤，滤余液用蒸馏水稀释，用100 mL容量瓶定容。

2.1.5 白芨蛋白正交试验确定酶解的最佳条件 由2.1.4实验结果可知，Sevag法除蛋白的效果远不如酶解法除蛋白的效果，酶解法除蛋白为白芨多糖纯化的优选方法。故确定用正交试验来研究加酶量、酶解温度、酶解时间及底物溶液浓度对白芨蛋白酶解的影响以确定最佳酶解条件。

2.1.6 白芨多糖提取纯化最佳条件的验证 根据上述实验结果，确定白芨多糖提取纯化最佳条件为：用10倍量蒸馏水55℃超声提取60 min，2遍，过滤，合并滤液，滤液用浓度20%盐酸溶液或20%氢氧化钠溶液调节pH至6.5，加入中温型α-淀粉酶3‰(w∶v)于60℃水浴下水解3 h，在调节pH至7.5，调整底物浓度为4 mg·100mL-1，加入3‰(w∶v)植物蛋白酶于45℃水浴下搅拌酶解3 h，粗滤，用10 000分子量超滤膜超滤，滤余液继续减压浓缩至稠膏状，再在真空干燥箱中干燥、粉碎，即为白芨多糖。取样品进行验证试验。

2.2 结果与讨论

2.2.1 白芨多糖单因素最佳提取条件结果 白芨多糖最佳提取条件用两种方法进行研究结果见表1。

表1 提取方法对提取率的影响 (n=5)

超声波水提法单因素最佳提取条件为：取5.00 g白芨粉末用10倍量蒸馏水超声波提取45 min，超声提取2次，超声提取温度45℃，平均提取率为85.52%。

水热回流提取法单因素最佳提取条件为：取5.00 g白芨末粉用20倍量蒸馏水65℃热回流提取3 h，水热回流提取3次，平均提取率为72.84%。

白芨多糖超声波水提法的提取率高于白芨多糖水热回流提取法的提取率12.66% ，白芨多糖超声波水提法为白芨多糖提取的优选方法。

2.2.2 正交试验确定白芨多糖提取最佳条件结果 正交试验条件因素见表2，正交表L9(34)及结果见表3，白芨多糖提取率直观分析结果见表4，白芨多糖提取率方差分析结果见表5。

表2 正交试验条件因素

表3 正交表L9(34)及试验结果

表4 白芨多糖提取率直观分析结果

表5 白芨多糖提取率方差分析结果

由直观分析表4可以看出，极差最大的为A因素，其次分别为B因素、D因素，极差最小的为C因素,说明在超声提取中，提取温度对白芨多糖提取率影响最大，其次为料液比和提取时间，影响最小的为提取次数。由方差分析表5可以看出，有特显著意义(F0.01

2.2.3 白芨多糖中蛋白单因素确定最佳去除条件结果 白芨多糖中蛋白去除两种方法进行研究结果见表6。

表6 去除方法对提取率的影响 (n=5)

白芨多糖中蛋白Sevag法去除单因素最佳条件为：滤液浓缩至1 ∶5(w∶v)，加入0.2倍体积的氯仿及0.04倍的正丁醇。混合剧烈振荡20 min，静置分层，弃去有机溶剂、变性蛋白(下层)及少量糖液层，保留糖液层(上层)，重复除蛋白7次。

白芨多糖中蛋白酶解法去除单因素最佳条件为：底物溶液浓度4 mg·100 mL-1，加入植物蛋白酶3‰(w/v)于45℃下搅拌酶解3 h。

白芨多糖中蛋白酶解法去除效果高于白芨多糖中蛋白Sevag法去除效果，白芨多糖中蛋白酶解法去除为白芨多糖提取纯化的优选方法。

2.2.4 白芨蛋白正交试验确定酶解最佳条件结果 用正交试验来研究加酶量、酶解温度、酶解时间及底物溶液浓度对白芨蛋白酶解的影响以确定最佳酶解条件。

表7 正交试验条件因素

表8 正交表L9(34)及试验结果

表9 白芨多糖提取率直观分析结果

表10 白芨多糖提取率方差分析结果

由直观分析表9可以看出，极差最大的为A因素，其次分别为B因素、D因素，极差最小的为C因素,说明酶解对白芨多糖提取率影响最大的因素为酶解温度，其次为酶解时间和加酶量，底物浓度影响最小。由方差分析表10可以看出，有特显著意义(F0.01

2.2.5 白芨多糖提取纯化最佳条件的验证 白芨多糖提取纯化最佳条件的验证结果如下，见表11。

表11 白芨多糖提取纯化最佳条件的验证结果

3 讨论

(1)高温(85℃-95℃)有利于多糖的溶解与浸出，由于白芨原料中淀粉含量较高，高温使其糊化而严重影响白芨多糖的溶解与浸出，而超声波提取(25～65℃)具有加速植物中有效成分进入溶剂，增加浸出率等诸多有利因素，故白芨多糖采用水超声波提取优于水热回流提取。

(2)白芨多糖中蛋白酶解法去除效果不仅仅在于高于Sevag法，而且是避免了采用Sevag法有有害溶剂残留而影响产品在食品、保健品中的应用，更使得酶解法结合超滤法使白芨多糖生产实现连续化、规模化的生产。

(3)白芨中含有大量白芨多糖，其溶胀性严重影响其溶解与浸出，故采用料液比不是热回流提取的10倍、超声提取的6倍，而是热回流提取的20倍、超声提取的10倍。

(4)本工艺也为白芨多糖多肽全营养产品生产提供了参考。