盘基网柄菌DJ-1基因的克隆及生物信息学分析

陈苏维,崔钰莹,侯碧巍,张唯玉,鲁佳佳

(安康学院 现代农业与生物科技学院,陕西 安康 725000)

前言

盘基网柄菌是美国国立卫生研究院公布的10种模式生物之一，正常情况下以单细胞形式生存繁殖，食物缺乏即分泌环腺苷酸(cAMP)吸引周围单细胞汇集成多细胞 "蛞蝓(slug)"[1～2]。此单细胞和多细胞共存的生活史使其展现出多种表现型，如生长、分裂、趋光性和趋热性等，而这些特征使得研究高等生物基因型与表现型间的复杂相关性变得简单且可操作性强[3～5]。

DJ-1最初被认为是一种原癌基因，与人类肿瘤和癌症发生相关，在精子的成熟和受精方面也起重要作用[6]。自从Bonifati等在帕金森病人家族内发现DJ-1基因突变型，证实DJ-1也与帕金森病发生相关，且具有遗传规律性[7]。关于DJ-1的功能和与其它基因之间的互相作用，一些学者进行了探索[8-11]，但研究结果尚未完全阐明其作用机制，而且研究结果之间存在一定差异。本研究通过对盘基网柄菌DJ-1基因进行克隆和生物信息学分析，旨在为后期利用盘基网柄菌模型研究DJ-1基因的功能和作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用菌株为大肠杆菌E.coliDH5α和盘基网柄菌D.discoideumAX2，其信息见表1。pUC18质粒，限制性内切酶EcoRI和NdeI，Taq DNA聚合酶，PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit购自上海生物工程有限公司。

表1 实验菌株及其基因型

1.2 方法

1.2.1 盘基网柄菌总基因组提取 从生长克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)的标准培养基上收集大约107个盘基网柄菌细胞，2 500 r·min-1室温离心30 s，将收集的细胞用盐溶液冲洗4次去除残留的克雷伯氏菌，然后用1 ml DNAzol 4 ℃放置30 min对细胞进行裂解。裂解液室温12 200 r·min-1离心10 min，然后取上清液用0.5 mL 100 %酒精进行沉淀，8 600 r·min-1离心5 min。沉淀所得DNA用1 mL 70 %酒精洗涤3次后，悬浮于100 μL 8 mM 氢氧化钠溶液4 C 短期贮存或 -20℃长期贮存。

1.2.2 PCR引物的设计与合成 参照dictyBase公布的基因序列，利用Primer5.0设计DJ-1序列的特异性引物(表2)，并由Geneworks公司进行合成。

表2 盘基网柄菌DJ-1基因的上、下游引物序列

1.2.3 盘基网柄菌DJ-1基因PCR扩增 以盘基网柄菌总基因组DNA为模板，利用1.3合成的引物扩增DJ-1基因全长序列。反应体系如下：盘基网柄菌总基因组DNA模板 2 μL，上、下游引物(10 μM)各1 μL，Taq DNA 聚合酶 1 μL，dNTP 混合物(10 mM)2 μL，MgCl2(50 mM)5 μL，PCR 缓冲液(10 x)10 μL，ddH2O 78 μL，共100 μL。PCR扩增的反应条件和参数如下：①总基因组DNA模板变性：95 C·5 min-1；②变性：95 C·1 min-1，退火：50 C ·1 min-1，延伸：72 C·2 min-1，共35个扩增循环；③最后延伸：72 C·10 min-1。1 %琼脂糖凝胶电泳检测扩增PCR产物。

1.2.4 扩增DJ-1的限制性酶切、连接、阳性克隆子筛选及酶切鉴定与测序 将PCR扩增的DJ-1与pUC18利用EcoRI进行限制性内切并连接，形成连接产物pUC18-DJ-1。通过电穿孔法将pUC18-DJ-1转化至E. coli DH5α，利用蓝-白斑法进行转化株筛选，获得DJ-1阳性克隆子。利用碱裂解法从E. coli DH5α菌株中抽提pUC18-DJ-1，经双酶切进行鉴定后由Geneworks公司进行测序。

1.2.5 盘基网柄菌DJ-1基因的生物信息学分析 用MEGA7.0软件构建盘基网柄菌DJ-1的系统进化树，分析采用自举分析Bootstrap，设500次重复；利用Protparam软件分析盘基网柄菌DJ-1的理化性质；利用TMHMM和SignalP 4.1 Server软件分别预测DJ-1蛋白的跨膜结构和信号肽；利用Predotar软件预测DJ-1蛋白的亚细胞位置；利用SMART软件预测DJ-1蛋白质的结构域；利用SOPMA和SWISS-MODEL软件分别预测DJ-1蛋白质的二级和三级结构。

2 结果

2.1 盘基网柄菌DJ-1基因的克隆

利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DJ-1的PCR扩增结果发现，盘基网柄菌DJ-1基因大小为600 bp左右，目的条带清晰，与预期结果一致(图1A)。利用EcoRI和NdeI双酶切验证结果与预期相符(图1B)。

2.2 盘基网柄菌DJ-1的生物信息学分析

2.2.1DJ-1核苷酸同源序列比对 测序结果表明：盘基网柄菌DJ-1基因全长618 bp，不含内含子，共编码205 个氨基酸。将测序所得盘基网柄菌DJ-1基因序列与GenBank公布的13株不同来源DJ-1核苷酸序列进行对比。结果显示本研究所用盘基网柄菌AX2菌株的DJ-1核苷酸序列与盘基网柄菌AX4菌株完全相同，与其同属不同种D.purpureum相似度为69 %，而与梭菌属10个不同菌株的相似程度介于67%～73 %之间(图2)。

2.2.2DJ-1 蛋白系统进化分析 对本研究盘基网柄菌AX2的DJ-1序列和2.2.2检索的13个同源序列采用邻接法(Neighbor-Joining, NJ)进行系统发育进化分析。结果表明：盘基网柄菌属(Dictyostelium)与梭菌属(Clostridium)形成两个分支，盘基网柄菌本属内D.discoideum与D.purpureum两个种亲缘关系较近，而D.discoideum种内两个菌株AX2和AX4属于同源(图3)。

2.2.3DJ-1蛋白的理化性质分析DJ-1蛋白理化性质研究结果表明：DJ-1分子量约为22.87 kD，分子式为C1020H1616N268O311S8，其理论等电点为5.31。DJ-1含86个非极性氨基酸(A、F、V、L、I、P、W和M)和119个极性氨基酸，其中极性氨基酸包括28个酸性氨基酸(D和E)、26个碱性氨基酸(H、K和R)和65个中性氨基酸(N、C、Q、G、S、T和Y)。DJ-1带负电荷的残基总数为28个，带正电荷的残基总数为24个，其脂溶指数(Aliphatic index)为92.20，总疏水性平均值(Grand Average of Hydropathicity, GRAVY)为-0.124，说明盘基网柄菌DJ-1蛋白能溶于非极性溶剂，属于疏水性蛋白质。盘基网柄菌DJ-1蛋白的不稳定指数(instability index)为27.24(<40)，表明其蛋白质结构相对稳定。

2.2.4DJ-1蛋白的跨膜区、信号肽分析及结构域预测 蛋白跨膜区及信号肽研究分析结果表明：盘基网柄菌DJ-1蛋白位于膜外，无跨膜结构和信号肽识别序列，也没有明显的结构域。

2.2.5DJ-1蛋白的二级和三级结构预测 二级结构预测发现：盘基网柄菌DJ-1蛋白含α-螺旋80个，占39.02 %；β-转角15个，占7.32 %；无规卷曲68个，占33.17 %；延伸链42个，占20.49%(图4)。SWISS-MODEL预测了盘基网柄菌DJ-1蛋白的立体空间结构模型(图5)。

2.2.6DJ-1 蛋白的亚细胞定位 盘基网柄菌DJ-1蛋白亚细胞定位结果表明：DJ-1蛋白可能位于细胞内质网上(表3)。

表3 利用Predotar预测盘基网柄菌DJ-1蛋白质的亚细胞位置

3 讨论

最早在意大利和荷兰分别发现了DJ-114 000个碱基对缺失和L166P点突变引起帕金森病相关症状，而且其流行性具有孟德尔遗传规律，从而证实帕金森病不是由环境变化随机引起的生理缺陷，而是随年龄增长而发生的神经退行性疾病[7,12]。随后的研究进一步揭示DJ-1的突变可能会造成蛋白质异常累积或磷酸化、氧化应激和线粒体功能紊乱[13]，而其机制可能与DJ-1蛋白的亚细胞位移有关[14]，也有学者认为DJ-1通过分子伴侣、转录因子或蛋白水解酶等执行其对细胞的保护作用[15～17]，或者与其它疾病相关基因互相作用执行其功能[18～19]，但其具体功能和作用机制尚不明确。

盘基网柄菌是一种简单的真核模式生物，其线粒体基因组和单倍体核基因组序列已被破译[20]，且其遗传转化、反意义链或小RNA干涉基因表达、蛋白质GFP标记、表现型分析等基因操作技术已被广泛使用，这些优点使得在高等生物上无法完成的基因操作成为可能且可信度高[21～22]。

笔者研究克隆了盘基网柄菌的DJ-1基因，并对其进行了测序，发现该基因克隆成功，无序列缺失或碱基突变，具有完整的开放阅读框。同时利用核苷酸序列进行跨膜区域和信号识别序列分析发现，DJ-1没有明显的跨膜序列与信号肽，说明其亚细胞位置可能与线粒体无关。亚细胞位置预测认为其可能位于内质网上，属于较稳定型胞内蛋白。DJ-1蛋白质的三级结构预测也发现了其活跃而保守的催化位点C117，这个位点与人类DJ-1蛋白质C106相对应。这些为今后建立盘基网柄菌DJ-1基因的原核及真核表达载体、在盘基网柄菌野生株内进行DJ-1蛋白的抑制和过表达并判断其表达量改变与盘基网柄菌表现型之间的相关性、DJ-1亚细胞位置与细胞应激之间的关系、C117活性位点的功能等奠定基础。另外，盘基网柄菌DJ-1基因的成功克隆也为后期利用GFP标记研究正常和氧化应激条件下DJ-1蛋白与线粒体定位的关系、建立DJ-1基因功能和作用机制的盘基网柄菌模型提供理论基础。