猪轮状病毒、猪札幌病毒和猪星状病毒三重PCR检测方法的建立及应用

曲雅新，孙连静，张胜斌，王若木，杨春杰，钟莲，周学光，黄克宏，罗期方，陈樱，韦祖樟，黄伟坚，欧阳康*

(1.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005；2.广西农垦永新畜牧集团西江有限公司，广西 贵港 537104)

猪轮状病毒(porcine rotavirus，PRoV)、猪札幌病毒(porcine Sapovirus，PoSaV)、猪星状病毒(porcine astrovirus，PAstV)是严重危害生猪养殖业的肠道病原，临床上常以腹泻、呕吐和厌食为特征[1-4]。猪轮状病毒属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus)，猪的A群PRoV是引起新生仔猪和断奶仔猪急性腹泻的常见病原体[5-7]，此病毒在猪场中阳性感染率为3.30%～67.30%[2]；猪星状病毒为星状病毒科(Astroviridae)成员，该病毒可感染各年龄段的猪[8-9]。2010年兰家暖等[10]曾对广西及广东腹泻猪粪便样品进行检测，发现猪星状病毒阳性率高达82.8%。猪札幌病毒是杯状病毒科(Caliciviridae)、札幌样病毒属成员，该病毒在全世界流行，断奶仔猪感染率最高且常呈混合感染，此病毒具有复杂的遗传多样性[11-13]。沈权[14]曾发现一株猪源毒株与人源毒株高度同源；陈琰[15]、Saif等[16]曾在粪便中发现札幌病毒、轮状病毒和星状病毒的混合感染。

猪群感染PRoV、PoSaV、PAstV后，其临床症状及病理变化相似，临床上难以区分，必须依靠实验室检测技术才能进行鉴别诊断，给猪群腹泻疾病的防控带来较大困难。目前常用的诊断方法有电镜观察、病毒的分离、血清学方法等，但是这些方法存在操作繁琐、耗时长等缺点，多重PCR检测方法因检测成本低廉、效率高、耗时短等被广泛应用于临床疾病的检测，另外，多重PCR检测方法更适用于临床混合感染的检测。本研究旨在建立快速、准确鉴别PRoV、PoSaV和PAstV临床感染的检测方法，为猪群腹泻疾病的监测和防控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株与临床病料样品

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、PRoV、PAstV、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)均由本实验室分离并保存，PoSaV阳性材料为本实验室保存临床病料，猪瘟病毒(CSFV)阳性材料为本实验室所购疫苗。试验所用的80份临床样品为肠内容物，采自于2018年6月至2019年5月广西、广东以及云南等地发生腹泻的规模猪场。

1.1.2 主要试剂

病毒DNA/RNA提取试剂盒、2×TaqPlus Master Mix Ⅱ、DL1 000 DNA Marker购自北京康为世纪生物科技有限公司；pMD18-T载体、AMV反转录试剂盒、质粒抽提试剂盒等均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

参考GenBank上发表的PRoV毒株(登录号:MF940551.1)、PoSaV毒株(登录号：KX688107)、PAstV毒株(登录号：KF787112.2)基因序列，在基因保守区域进行引物设计，应用Oligo 6.0软件对所选区域进行分析，设计出3对特异性引物(表1)，分别用于PRoV VP6基因、PoSaV RdRp基因、PAstV ORF1基因的扩增，预期扩增片段分别为160、299和466 bp。引物序列由生物公司上海杰李合成。

表1 引物信息

1.2.2 RNA的提取与反转录

样品经12 000 r/min 4 ℃ 离心5 min后，取上清按照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书抽提病毒总RNA并进行反转录，产物于-20 ℃保存备用。

1.2.3 单重PCR扩增

以PRoV、PoSaV和PAstV的cDNA为模板，利用本研究设计的引物进行单重PCR检测，反应体系为：2×TaqPlus Master Mix Ⅱ 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板3μL，加ddH2O至25 μL。反应条件为：94℃ 3 min；94℃ 30 s、51℃ 30 s、72℃ 40 s，30个循环；72℃ 5 min；4℃保存。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。将得到的目的片段进行纯化并连接到pMD18-T载体，构建重组质粒p-PRoV，p-PoSaV和p-PAstV，将阳性质粒送至上海杰李生物技术有限公司进行测序。

1.2.4 三重PCR反应条件的优化

根据已建立好的单重PCR反应体系，对退火温度(48 ℃、49 ℃、50 ℃、51 ℃、52 ℃、53 ℃)进行优化；将引物终浓度稀释至0.125、0.250、0.375、0.500、0.625和0.750 pmol/μL，进行组合，筛选出最佳引物浓度；并对反应循环数(25、30、35、40、45)进行优化。

1.2.5 特异性试验

以PRoV、PoSaV、PAstV、PEDV、TGEV、CSFV、PRRSV的cDNA和PRV、PCV2的DNA为模板，在已建立的三重PCR反应条件的基础上进行PCR扩增，同时设置阴性对照，分析三重PCR的特异性。

1.2.6 敏感性试验

测定3种重组质粒的浓度并计算质粒拷贝数，将重组质粒等比例混合后，以10倍系列稀释至108～100拷贝数/μL，应用已建立的三重PCR方法进行扩增，同时设置阴性对照，分析三重PCR的敏感性。

1.2.7 重复性试验

以PRoV、PoSaV、PAstV的cDNA为模板，应用已建立的三重PCR方法进行扩增，共重复6次，同时设置阴性对照，验证本研究建立的三重PCR的重复性。

1.2.8 临床样品检测

应用本研究建立的三重PCR检测方法和单重PCR方法对所采集的80份腹泻样品同时进行检测，按照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书抽提病毒总RNA并进行反转录，对样品进行检测，将阳性样品的PCR扩增产物送至上海杰李生物技术有限公司进行测序。

2 结果

2.1 单重PCR扩增

以PRoV、PoSaV和PAstV的cDNA为模板，进行PCR扩增，获得大小为160、299和466 bp的目的片段(图1)，将扩增的目的片段纯化后连接到pMD18-T载体，将阳性重组质粒进行测序，将测序序列与NCBI上公布的参考株序列比对，确认质粒上连接的片段为本研究扩增的目的片段。

M.DL1 000 Marker；1.目的基因片段；2.阴性对照；A.PRoV VP6基因片段；B.PoSaV RdRp基因片段;C.PAstV ORF1基因片段图1 PCR扩增结果

2.1 三重PCR反应条件的优化

通过对反应退火温度、引物浓度以及反应循环数进行优化，确定反应最佳退火温度为50 ℃(图2)；PoSaV、PAstV的最佳引物浓度为0.125 pmol/μL，PRoV的最佳引物浓度为0.750 pmol/μL(图3)；反应的最佳循环数为35(图4)。

M.DL1 000 Marker；1～6.退火温度分别为：48 ℃、49 ℃、50 ℃、51 ℃、52 ℃、53 ℃图2 三重PCR退火温度优化

M.DL1 000 Marker；1～6.PoSaV、PAstV的引物终浓度为0.125 pmol/μL，PRoV的引物终浓度分别为0.750、0.625、0.500、0.375、0.250和0.125 pmol/μL图3 引物浓度优化

M.DL1 000 Marker；1～5.循环数分别为25、30、35、40、45图4 循环数优化

2.2 特异性试验

用PRoV、PoSaV、PAstV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV的cDNA和PRV、PCV2的DNA为模板，在已建立的三重PCR反应条件的基础上进行PCR(图5)，结果显示，PEDV、TGEV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2均无扩增产物，说明三重PCR的特异性良好。

M.DL1 000 Marker；1.三重混合质粒；2.PRoV；3.PoSaV；4.PAstV；5～10.分别为CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV、PRV、PCV2；11.阴性对照图5 三重PCR特异性试验

2.3 敏感性试验

测定3种重组质粒p-PRoV、p-PoSaV、p-PAstV的浓度并将质粒10倍系列进行稀释至108～100拷贝数/μL，用所建立的三重PCR方法进行检测(图6)，结果显示，PRoV的最低检测限量为1.38×102拷贝数/μL；PoSaV的最低检测限量为8.33×102拷贝数/μL；PAstV的最低检测限量为4.40×103拷贝数/μL。三重PCR具有较好的敏感性。

M.DL1 000 Marker；1-9.重组质粒浓度分别为108～100 拷贝数/μL；10.阴性对照图6 三重PCR敏感性试验

2.4 重复性试验

用PRoV、PoSaV、PAstV的cDNA为模板，在已建立的三重PCR反应条件的基础上进行PCR(图7)，共重复6次，同时设置阴性对照，结果显示，PRoV、PoSaV、PAstV三重PCR具有较好的重复性。

M.DL1 000 Marker；1～6.PRoV+PoSaV+PAstV；7.阴性对照图7 三重PCR重复性试验

2.5 三重PCR检测方法的临床应用

应用本研究建立的三重PCR检测方法对2018—2019年广西、广东以及云南等地规模猪场采集的80份临床腹泻样品进行检测，结果显示，PRoV、PoSaV及PAstV阳性样品均为4份，样品阳性率均为5.00%，其中有1份样品存在PRoV与PoSaV的混合感染，1份样品存在PAstV与PoSaV的混合感染，部分样品电泳图见图8。将单重PCR方法与本研究建立的三重PCR方法相对比，结果显示，2种方法的检测结果一致，阳性样品符合率为100%。阳性样品的扩增产物经测序验证，其结果相一致。

M.DL1 000 Marker；1.三重混合质粒；2～7.临床样品；8.阴性对照图8 三重PCR临床样品检测

3 讨论

近年来，在规模化猪场中因多种病毒混合感染引起猪腹泻的报道日益增多，严重危害生猪的养殖。由于PRoV、PoSaV和PAstV这3种病毒所引起的临床症状和病理变化相似很难区分，给疾病的诊断造成了不小的挑战，故需一种方法能够快速对其进行鉴别。多重PCR不仅克服了电镜观察、病毒分离、免疫组织化学、血清学等诊断技术操作复杂、准确率较低、耗时长等[17-18]缺点，且检测成本低廉、耗时短、效率高，故建立一种能够同时、快速检测出这3种病毒的检测方法在临床诊断和病原监测方面具有重要意义。目前，已报道有李军等[19]建立了TGEV、PEDV、PRoVA的多重荧光定量RT-PCR检测方法；罗欣[20]建立了诺如病毒GⅠ型和GⅡ型、腺病毒、星状病毒和札如病毒的五重PCR检测方法；杨文宇等[17]建立了PRoVA、PRoVC、PAstV三重PCR检测方法，但尚未有报道可同时鉴别PRoV、PoSaV和PAstV的检测方法。因此，本研究在3种病毒保守区设计引物建立一种特异、有效、敏感的鉴别诊断方法，为PRoV、PoSaV和PAstV的快速鉴别诊断以及流行病学调查提供帮助。

应用所建立的方法对2018年6月至2019年5月采自广西、广东、云南的80份临床腹泻样品进行检测，结果显示：各病毒感染率均为5%，轮状病毒检测结果与使用陈静[21]所设计的引物检测结果一致，猪星状病毒检测结果阳性率略高于实验室检测结果；同时试验还发现，在这80份临床腹泻样品中存在1例猪札幌病毒与猪轮状病毒以及1例猪札幌病毒与猪星状病毒的双重感染。对于病毒的混合感染，陆琰[15]、Saif等[16]使用免疫电镜法在腹泻仔猪的粪便中首次观察到猪札幌病毒，同时在该粪便中发现轮状病毒和星状病毒；Shimizu等[22]提出星状病毒在世界各国的猪群中普遍存在，发生单一病毒感染的情况很少见，这与本次试验所发现病毒存在混合感染的现象相似。在一定程度上提示生猪养殖时要加强多病原的预防。

有研究表明，猪源星状病毒有感染人类或其他物种的可能性[23]。已有文献报道来自动物的星状病毒和人源星状病毒之间的重组事件[24]；猪源札幌病毒与人源札幌病毒具有较高同源性[25-27]，且已分离到由人源和猪源札幌病毒之间通过基因重组产生的新毒株[28-30]，这提示札幌病毒可能具有在人与动物之间跨种传播的能力。同样轮状病毒在婴儿和其他哺乳动物中广泛存在，也是引起新生仔猪和断奶仔猪急性腹泻最常见的因素，易继发细菌感染[7]。

综上所述，本研究建立的猪轮状病毒、猪札幌病毒和猪星状病毒三重PCR检测方法不仅为猪场腹泻病的监测和防控提供技术支持，更是对潜在人畜共患病的监测具有公共卫生意义。