17种消毒剂对大肠杆菌、沙门菌及金黄色葡萄球菌的杀菌试验

邓同炜，齐亚如，石月航，郭冰洁，蒋增海，彭志锋，徐耀辉,2*

(1.河南牧业经济学院动物医药学院，河南 郑州 450046；2.河南省家禽疾病防控工程技术研究中心，河南 郑州 450046)

随着畜禽养殖模式向规模化、集约化发展，在提高生产效率的同时，饲养密度的增加也增大了动物传染病的传播机率和速度[1]。除了疫苗接种和药物防控外，做好饲养环境卫生、消毒等生物安全措施对于畜禽传染病防控至关重要。规范的消毒措施已成为降低环境中病原微生物数量的有效手段。消毒剂在杀灭病原时所需要的浓度和作用时间也会随着环境温度和畜舍中有机物浓度大小等的影响发生改变。使用浓度过高的消毒液会造成对消毒剂的浪费，增加了成本，甚至会对环境造成污染和危害，使用浓度过低的消毒液会导致病原菌不能被完全杀死[2-3]。养殖场消毒作为一项经常性工作，也存在由于长期使用相同的消毒剂导致病原菌产生了耐药性，杀菌效果降低[4]。

目前，市场上用于养殖场的消毒剂种类繁多，消毒效果也存在一定程度差异，合理选择使用消毒剂成为消毒成败的关键因素之一[5-6]。实际生产中，养殖场在选择与使用消毒剂时，往往存在一定的盲目性。本试验以禽源大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌为受试菌，采用悬液定量杀菌试验比较养鸡场17种常用消毒剂杀菌效果，并选择其中9种性价比高的消毒剂，在不同浓度的有机物干扰下进行杀菌试验，为养殖场消毒剂的选择与使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株

大肠杆菌(菌株编号18-2-26)、德尔卑沙门菌(菌株编号18-SD-3)和金黄色葡萄球菌(菌株编号18-SA-1)由河南牧业经济学院动物传染病实验室分离保存。

1.2 主要试剂

普通营养琼脂、MH肉汤、牛血清白蛋白(BSA)。

1.3 消毒剂

试验用消毒剂：金保安(海南育奇药业有限公司生产)、醛力美(新乡市百医百顺动物药业有限公司生产)、新欧福(瑞普(天津)生物药业有限公司生产)、戊二醛癸甲溴胺(河南后羿实业集团有限公司生产)、安灭杀(英国考文垂化学药品有限公司生产)、乐福醛(河南大华生物技术有限公司生产)、瘟毒净(徐州金牌药业公司)、泛福露益溶液(广州市畜牧科学研究所动物保健实验药厂生产)、氯甲酚(上海康利得动物药品有限公司生产)、复合酚(齐鲁动物保健有限公司生产)、卫可1(英国安德国际有限公司生产)、卫可2(杜邦公司生产)、安立消(瑞普(天津)生物药业有限公司生产)、月苄三甲氯胺(江苏康巴特生物工程有限公司生产)、百敌克(美国龙沙公司生产)、百能(广东嘉华生物科技有限公司生产)、新洁尔灭(北京中农大生物技术股份有限公司生产)，共17种消毒剂。

1.4 17种消毒剂对3种病原菌最小杀菌浓度的确定

将17种消毒剂，采用试管二倍稀释法[7-8]，以消毒剂推荐喷雾使用浓度为中间值，向上稀释3个浓度，向下稀释2个浓度。将大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌各2株分别划线于普通营养琼脂平板上37 ℃ 24 h，挑取单个菌落接种于5 mL营养肉汤，对比比色卡培养至0.5麦氏浓度，即1×108cfu/mL。取0.1 mL制备好的菌悬液，分别加入含有不同浓度消毒剂的肉汤中，每株菌做1个重复，放入37 ℃摇床培养18～20 h。设1管阳性对照(菌液+双倍肉汤)，1管阴性对照(双倍肉汤)，计数结果取平均值。

以无细菌生长的消毒剂最高稀释度浓度为该消毒剂的最小杀菌浓度(MBC)，用平板计数方法确定。平板上菌落数≤5个，视为无细菌生长[7-8]。

1.5 不存在有机干扰物时9种消毒剂对受试菌的杀菌效果比较

根据1.4试验结果，先将消毒剂配成各自相应的2 MBC浓度。每个离心管中加入2.5 mL 2 MBC消毒剂、2.5 mL双倍肉汤、0.1 mL菌悬液，在不同时间点：5 min、1 h、12 h、24 h、48 h、72 h，分别取100 μL 倍比稀释后平行涂板于普通营养琼脂，37 ℃培养24 h计数，每个稀释度涂培养基平板2个，结果取平均值。以无菌超纯水代替消毒剂作为阳性对照，以无菌超纯水代替消毒剂和菌悬液作为阴性对照[7-8]。

杀灭率=(消毒前细菌数-消毒后细菌数)/消毒前细菌数×100%

1.6 存在有机干扰物时9种消毒剂对受试菌的杀菌效果比较

1.6.1 有机干扰物浓度的选择

将干扰物BSA预先配成0.3%、10%的浓度，根据1.5试验结果，选择无干扰物存在时消毒剂的最小杀菌浓度进行定量杀菌试验，若均有细菌生长，可提高消毒剂浓度，暂定为干扰物终浓度为0.03%、1%时消毒剂的浓度分别选择其MBC的1倍、2倍。

1.6.2 有机干扰物对消毒剂杀菌的干扰试验

在离心管中分别加入0.4 mL菌悬液、0.6 mL干扰物、2 mL 3倍肉汤、3 mL消毒剂，进行定量杀菌实验；在不同时间段吸100 μL 涂布于普通营养琼脂平板，每个时间点平行涂培养基平板2个，37 ℃培养24 h计数，结果取平均值。以无菌超纯水代替消毒剂作为阳性对照，以无菌超纯水代替消毒剂和菌悬液作为阴性对照。

2 结果

2.1 17种消毒剂对大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌消毒效果的比较

结果如表1所示，MBC一般高于推荐喷雾浓度一倍以上，其中百敌克的MBC最小。成分为戊二醛+癸甲溴铵的四种消毒剂(金保安、醛力美、新欧福、戊二醛癸甲溴铵)中，金保安的杀菌效果最差，其余三种效果相差不大。有效成分相同的卫可1、卫可2杀菌效果相近，安立消、月苄三甲氯铵杀菌效果相近。杀灭金黄色葡萄球菌所需消毒剂最小杀菌浓度普遍低于大肠杆菌。

表1 不同消毒剂对3种病原菌的杀菌效果比较

对17种消毒剂进行综合比较，选出9种性价比较高的消毒剂：戊二醛癸甲溴铵溶液、醛力美、新欧福、乐福醛、安灭杀、百敌克、百能、月苄三甲氯铵溶液、安立消。以每种消毒剂对大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌三种菌MBC中最低稀释倍数的浓度进行下一步试验。

2.2 无有机干扰物存在时9种消毒剂对受试菌杀菌效果的比较

无干扰物存在时，乐福醛对金黄色葡萄球菌杀灭效果最差，5 min、1 h、12 h、24 h均不能完全杀灭金黄色葡萄球菌，直至48 h时才完全杀灭，72 h时杀菌作用已消失，总体杀菌效果比其他8种消毒剂差。在5 min时，安灭杀、百能、醛力美即可对大肠杆菌杀灭率达到100%，但不能全部杀灭金黄色葡萄球菌；在1 h时，醛力美对金黄色葡萄球菌可100%杀灭，安灭杀、百能仍不能全部杀灭；随着时间延长，在12 h开始对细菌杀灭率达到100%，直至72 h(72 h后未检测)。戊二醛癸甲溴铵、新欧福、百敌克、月苄三甲氯铵、安立消在5 min即可对大肠杆菌与葡萄球菌杀灭率达到100%，直至72 h(72 h后未检测)。结果见表2。

表2 无干扰物时9种消毒剂对受试菌的作用效果

2.3 存在有机干扰物时9种消毒剂对受试菌杀菌效果的比较

结果见表3。在0.03% BSA、1MBC消毒剂浓度下，戊二醛癸甲溴铵、醛力美、新欧福、安灭杀、百敌克、安立消6种消毒剂5min时即可对大肠杆菌杀灭率100%，直至72 h；百能、月苄三甲氯铵从1 h开始，乐福醛从12 h开始，直至72 h对大肠杆菌杀灭率100%。在同样的干扰物浓度和消毒剂浓度下，百敌克、月苄三甲氯铵5 min时即对金黄色葡萄球菌杀灭率100%，直至72 h；戊二醛癸甲溴铵在1 h、新欧福、安灭杀、安立消在12 h、乐福醛在48 h对金黄色葡萄球菌杀灭率100%，直至72 h；醛力美直至72 h，才能对金黄色葡萄球菌全部杀灭。

表3 存在干扰物时9种消毒剂对受试菌的作用效果

将干扰物BSA浓度加大至1%、消毒剂浓度加大至2 MBC时，百敌克、月苄三甲氯铵、安立消5 min时即可对大肠杆菌杀灭率100%，直至72 h；新欧福、安灭杀、百能从1 h开始，醛力美、乐福醛从12 h开始，戊二醛癸甲溴铵从24 h开始对大肠杆菌杀灭率100%。

在同样的干扰物浓度和消毒剂浓度下，月苄三甲氯铵在1 h，戊二醛癸甲溴铵、百敌克、百能、安立消在12～24 h对金黄色葡萄球菌杀灭率100%，乐福醛、安灭杀在72 h内均不能杀灭全部金黄色葡萄球菌。

上述研究结果表明：有机干扰物浓度越大，所需要的消毒剂浓度越高，杀灭细菌需要时间越长；9种消毒剂抗有机物干扰能力不同；在相同浓度的有机物干扰下，消毒剂对不同细菌的抗干扰能力也不相同，杀灭金黄色葡萄球菌所需时间长于大肠杆菌。月苄三甲氯铵、百敌克、安立消、新欧福抗有机物干扰的能力较强。

3 讨论

大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌是重要的人兽共患病原菌，对动物和人的危害巨大。鸡舍中上述3种菌广泛存在[1,9-10]。因此，本研究选择这3种细菌进行试验，具有一定代表性。本研究中17种消毒剂杀灭金黄色葡萄球菌最小杀菌浓度普遍低于大肠杆菌，可能与细菌细胞壁结构有关，其他研究者也有相似的报道[11]。其中安灭杀、安立消以及月苄三甲氯铵的MBC均小于推荐喷雾浓度；乐福醛、瘟毒净的的MBC均大于推荐喷雾浓度，也高于毛倩倩等[12]的报道。其余12种消毒剂的MBC值与推荐喷雾使用浓度基本一致。17种消毒剂之间消毒效果均存在差异,即使成分完全相同的消毒剂，其最小杀菌浓度也不同，比如成分相同的4种消毒剂(金保安、醛力美、新欧福、戊二醛癸甲溴铵)，金保安对3种试验菌株MBC大于推荐使用浓度的4～5倍，其余三种除对金黄色葡萄球菌MBC与推荐使用浓度一致外，对大肠杆菌、沙门菌MBC均大于推荐使用浓度；主要成分相同的安立消、月苄三甲氯铵消毒效果相差不大，但其MBC值均大于王继[13]和李雯等[14]的报道；复合酚的MBC值大于李宝栋等[15]报道的复合酚对总菌落数的杀菌效果，瘟毒净的MBC小于李雯等[14]的报道。

畜禽养殖场消毒会受到消毒对象、有机物、温度、作用时间、污染物、消毒方式等因素的影响[16-18]，因此消毒时需根据消毒对象选择适宜的消毒剂并适当调整使用浓度，以期达到较好的消毒效果。本研究使用不同浓度干扰物模拟养殖环境洁净程度差异，干扰物浓度≤0.03%时，模拟环境洁净度较好的养殖场；干扰物浓度为1%时模拟环境洁净度较差的养殖场。试验结果表明，有机干扰物浓度越大，所需要的消毒剂浓度越高。戊二醛癸甲溴铵、醛力美抗干扰能力较弱，月苄三甲氯铵、百敌克、安立消、新欧福抗有机物干扰的能力较强。根据本研究结果，建议消毒时使用月苄三甲氯铵、百敌克、安立消、新欧福4种消毒剂轮换使用。环境洁净度较差的养殖场，消毒前尽可能提高洁净度，并且通过加大消毒剂浓度至推荐使用浓度的2～4倍，延长消毒时间保证消毒效果。

细菌的抗生素和消毒剂存在共同耐药现象[19]。为减少细菌对消毒剂的抗性及食品安全风险，养殖场要定期清洁，保持良好的养殖环境[20-21]。不同消毒剂的消毒效果存在差异，建议具备条件的养殖场选用消毒剂时，结合实验室手段，对比不同消毒剂的MBC值，合理选择及使用消毒剂。