汤姆青霉的抗菌活性研究

赵文婧，翟飞红，吴丽华，燕平梅，李 娜

（太原师范学院生物系，晋中 030619）

青霉（Penicillium）是自然界中一个非常重要的真菌类群，广泛地存在于自然界中，空气、土壤和腐烂的物质上均可发现其存在。它与人类的关系十分密切，其发酵产物等均可以用于抗生素的制备。众所周知，青霉素主要是由产黄青霉（P.chrysogenum）产生的，它是最早被发现、最先被提纯并最早应用于临床的抗生素。灰黄青霉（P.griseofulvum）产生的灰黄霉素是抑制诸如脚藓之类的真菌性皮肤病最好的抗生素。本实验室从山西省汾阳混交林土壤中分离得到了一株汤姆青霉PT95菌株，该菌株能形成大量坚硬、沙粒状的微菌核，并能在菌核内积累类胡萝卜素。关于汤姆青霉PT95（P.thomiiPT95）菌株对氧胁迫的细胞响应前期已经做了详细的研究［1］，研究发现PT95菌株在不良环境下可以分化形成菌核，同时启动体内的各种抗氧化机制来抵御不良环境。如前所述，抗生素的制备很多都是从青霉菌代谢产物中提取出的，李浩华等［2］在海洋真菌汤姆青霉FS77（P.thomiiFS77）中做了相关的抗菌活性研究，发现P.thomiiFS77菌株的发酵液中存在抗菌物质［2］。为了证实青霉PT95菌株是否具有一定的抗菌性能，本文将采用牛津杯法和滤纸片法试验对汤姆青霉PT95抑菌活性进行研究，从7种待测菌种中筛选出具有最佳抑菌效果的菌种，并以此作为后续研究的对象，进行最小抑菌质量浓度的测定以及培养基的优化，为汤姆青霉PT95在抗菌方面的进一步研究及其应用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

汤姆青霉PT95保存于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agarose，PDA）培养基上。抑菌试验指示菌株大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）、黑根霉（Rhizopus nigricans）均保存于太原师范学院微生物学实验室。

1.2 培养基

1.2.1 液体培养基

本试验所用的液体培养基：乳酸菌MRS液体（lactobacilli DeMan-Rogosa-Sharpe broth，MRS broth）培养基、马铃薯葡萄糖液体（potato dextrose broth，PDB）培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基。

1.2.2 固体培养基

本试验所用的固体培养基：MRS固体培养基、PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基。

优化基础培养基的配方：葡萄糖10.00 g/L，蛋白胨5.00 g/L，MgSO4·7H2O 0.20 g/L，NaCl 3.00 g/L，琼脂 20.00 g/L，pH7.0～7.2［3］。

1.3 研究方法

1.3.1 菌株的培养及样品的制备

1.3.1.1 汤姆青霉PT95发酵液制备

用接种环挑取一环汤姆青霉PT95并接种于100 mL PDB培养基中，其中试验组中加入浓度为0.03 mmol/mL的环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP），对照组中不加 cAMP，分别置于25℃摇床中200 r/min振荡培养5 d。在超净台无菌操作过滤掉菌丝体［4］，留汤姆青霉PT95发酵液备用。

1.3.1.2 指示菌株的活化

取植物乳杆菌、德氏乳杆菌保存液各100μL，分别接种于50 mL MRS液体培养基中；取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌保存液各100μL分别接种于50 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中；挑取枯草芽孢杆菌接种于50 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中。将上述接好菌的培养基全部置于37℃摇床中150 r/min振荡培养24 h。

挑取适量黑根霉菌株接种于50 mL PDB培养基中，置于25℃摇床中150 r/min振荡培养24 h。

挑取适量酿酒酵母菌株接种于50 mL PDB培养基中，置于30℃摇床中150 r/min振荡培养24 h。

1.3.2 最佳抑菌效果菌株的筛选

1.3.2.1 滤纸片法检测发酵液的抑菌活性

将直径为1.2 cm的滤纸圆片高压蒸汽灭菌后备用，用灭菌镊子取灭菌滤纸片分别放入发酵上清液与无菌水中浸泡2 h备用。

吸取200μL活化好的各指示菌株分别放置于无菌培养皿中，待灭菌好的培养基冷却至50℃左右时，再取25 mL不同的培养基倒入相应加入指示菌株的培养皿中。待平板凝固好后，取上述滤纸片（以无液体滴下为准）放置于培养基上，每个平板放4个滤纸片（其中3个加发酵液，1个加无菌水），4个滤纸片间距大致相等，在各指示菌株的最适培养温度下分别培养 12～24 h。

1.3.2.2 牛津杯法检测发酵液的抑菌活性

将若干牛津杯置于小烧杯中灭菌备用。吸取200μL活化好的各指示菌株分别置于冷却后的无菌培养皿中，待灭菌好的培养基冷却至50℃左右时，再取25 mL不同的培养基分别倒入相应加入指示菌株的培养皿中。待平板凝固好后，用灭菌镊子夹取牛津杯放于培养基上，每个平板放4个牛津杯（其中3个加发酵液，1个加无菌水），4个牛津杯间距大致相等，然后吸取200μL发酵液或无菌水加入牛津杯中，在各指示菌株的最适培养温度下培养12～24 h。

依据抑菌率大小，从上述供试的7种指示菌中筛选出具有最佳抑菌效果的菌株，并将其作为后续试验的菌种。

抑菌率=（抑菌圈直径-牛津杯直径/滤纸片直径）/抑菌圈直径×100%。

1.3.3 最小抑菌质量浓度的测定

将汤姆青霉PT95的发酵液在50℃下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/5，然后加入95%乙醇进行沉淀，使发酵液最终浓度为75%，4℃冰箱放置2 d后离心，弃去沉淀，重复1次上述步骤，取上清液在50℃下浓缩成浸膏，冷却干燥成冻干粉备用［5］。

准确称取一定量的发酵液冻干粉用2.5%的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）分别配制成质量浓度为5.12、2.56、1.28、0.64、0.32、0.16 mg/mL的样品溶液［6-7］，并采用牛津杯法计算抑菌率来确定最小抑菌质量浓度。

1.3.4 培养基的优化

根据最佳抑菌效果菌种的筛选结果，在优化基础培养基上对碳源、氮源和无机盐进行筛选，通过测定抑菌率的大小对培养基进行优化。

1.3.4.1 最适碳源的筛选

分别以可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、麦芽糖代替优化基础固体培养基中的葡萄糖作为唯一碳源［8］，用筛选的高抑菌活性菌株制备液体菌种，采用牛津杯法计算抑菌率的大小。

1.3.4.2 最适氮源的筛选

分别以尿素、柠檬酸铵、氯化铵、磷酸二氢铵、硝酸铵、酵母膏替代优化基础固体培养基中的蛋白胨作为唯一氮源。用筛选的高抑菌活性菌株制备液体菌种，采用牛津杯法计算抑菌率的大小。

1.3.4.3 无机盐的筛选

在优化基础固体培养基中，分别加入KH2PO4、FeSO4、KH2PO4+FeSO4，加入的量均占其培养基总量的0.05%［9-10］，其他组分均相同，将筛选的高抑菌活性菌株制备液体菌种，采用牛津杯法计算抑菌率的大小。

1.3.4.4 最适MgSO4·7H2O质量浓度的筛选

在优化的基础固体培养基中，调节MgSO4·7H2O的质量浓度分别为0.10、0.20、0.30、0.40 g/L，其他成分保持一致［11］，将筛选的高抑菌活性菌株制备液体菌种，采用牛津杯法计算抑菌率的大小。

2 结果与分析

2.1 最佳抑菌效果菌株的筛选

采用滤纸片法和牛津杯法，利用十字交叉法测量抑菌圈的直径，通过抑菌率公式计算抑菌率，根据抑菌率确定最佳抑菌效果的菌株。

从表1可以看出，枯草芽孢杆菌可以作为具有最佳抑菌效果的指示菌株，其抑菌率可以达到56.37%。汤姆青霉PT95发酵液对金黄色葡萄球菌、酿酒酵母以及大肠杆菌均有抑菌活性，但是均低于对枯草芽孢杆菌的抑菌活性。从表中数据可以初步推断汤姆青霉PT95发酵液对德氏乳杆菌与植物乳杆菌可能有杀菌作用，对根霉没有抑制作用。

从表1和表2可以看到，加了cAMP的试验组与不加cAMP的对照组的汤姆青霉PT95发酵液结果基本相同，所以之后的一系列试验均采取不加cAMP的汤姆青霉PT95发酵液作为后续研究的对象。

表1 发酵液对不同指示菌株抑菌率的分析（%）Tab.1 Analysis of bacteriostatic rate of fermentation broth to different indicator strains (%)

表2 发酵液对不同指示菌株的抑菌圈直径（cm）Tab.2 Diameter of bacteriostatic circle of fermentation liquid to different indicator strains (cm)

图1为采用牛津杯法和滤纸片法得到的对枯草芽孢杆菌的抑菌图，其中图1a和图1d是没有添加cAMP的抑菌图，图1b和图1c是添加了cAMP的抑菌图。

根据图1培养皿中菌落形成情况以及抑菌圈的直径进行判断可知，牛津杯法较滤纸片法更适合抑菌试验。牛津杯法可以更好地控制汤姆青霉PT95菌株发酵滤液的量，抑菌圈更接近圆形，更便于测量，能尽可能地减小试验误差。

图1 两种方法测定有无cAMP的发酵液对枯草芽孢杆菌的抑菌作用Fig.1 Two methods to determine the bacteriostatic effect of the fermentation liquid with or without cAMP on Bacillus subtilis

2.2 最小抑菌质量浓度的测定

对汤姆青霉PT95发酵液进行蒸发浓缩和冷冻干燥，得到的冻干粉为黏稠状似胶质的棕黄色固体。对冻干粉进行最小抑菌质量浓度的试验，从表3中可以看出，汤姆青霉PT95发酵液对枯草芽孢杆菌的最小抑菌质量浓度为0.64 mg/mL。

2.3 培养基的优化

通过上述试验可确定枯草芽孢杆菌为具有最佳抑菌效果的菌种，选取其作为后续优化试验的菌株。在优化基础培养基上首先进行了抑菌试验，枯草芽孢杆菌的抑菌率达到65.40%，接着进行了最适碳源、氮源、无机盐的筛选。

2.3.1 最适碳源的筛选

用供试碳源代替优化基础培养基中的葡萄糖，保持碳含量一致。供试碳源有可溶性淀粉、蔗糖、乳糖和麦芽糖4种，结果见图2。

由图2可以看出，不同碳源对汤姆青霉PT95菌株抑制枯草芽孢杆菌的生长均具有一定的影响。在其他组分均相同的情况下，以麦芽糖为碳源时的抑菌率最高，且抑菌率可达70%，高于优化基础培养的抑菌率，其次为乳糖、蔗糖，而抑菌率最低的为可溶性淀粉。所以当以可溶性淀粉为碳源时，汤姆青霉PT95菌株对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最差。说明汤姆青霉PT95可以有效利用麦芽糖这一碳源产生一些抑菌活性物质，故可选取其作为最适碳源。

表3 发酵液提取样品对枯草芽孢杆菌的最小抑菌质量浓度测定（mg/mL）Tab.3 Determination of the minimum inhibitory concentration of the sample extracted from fermentation filtrate to Bacillus subtilis（mg/mL）

图2 最适碳源的筛选Fig.2 Selection of the most suitable carbon source

2.3.2 最适氮源的筛选

分别用磷酸二氢铵、尿素、柠檬酸铵、氯化铵、硝酸铵、酵母膏替代优化基础固体培养基中的蛋白胨作为唯一氮源。

磷酸二氢铵、尿素、柠檬酸铵、氯化铵为供试氮源时，枯草芽孢杆菌几乎不生长，说明枯草芽孢杆菌不能有效利用磷酸二氢铵、尿素、柠檬酸铵、氯化铵等无机氮来进行自身生长［11-14］。而以酵母膏为供试氮源时，枯草芽孢杆菌菌落生长均匀，但在牛津杯添加汤姆青霉PT95菌株发酵液后抑菌效果不是很明显。这表明改变优化基础培养基中的氮源并不能促进枯草芽孢杆菌的生长或提高抑菌率，因此优化基础培养基中的蛋白胨即为最适氮源成分。

2.3.3 无机盐的筛选

在优化基础固体培养基中分别加入KH2PO4、FeSO4、KH2PO4+FeSO4，结果发现，在加入无机盐的培养基中枯草芽孢杆菌长势较差，这说明枯草芽孢杆菌不能有效利用这些无机盐进行自身的生长繁殖，因此优化基础固体培养基中无需加入无机盐来提高抑菌率。

2.3.4 最适MgSO4·7H2O质量浓度的筛选

在优化基础培养基上，汤姆青霉PT95菌株的抑菌率可以达到65.4%。在优化培养基上分别添加不同质量浓度的MgSO4·7H2O，如图3所示。从图3可得知，MgSO4·7H2O的质量浓度在0.30 g/L的情况下抑菌率最高，可以达到67.57%，随着MgSO4·7H2O质量浓度的提高，其抑菌率开始下降，所以最适的MgSO4·7H2O质量浓度为0.30 g/L。

图3 MgSO4·7H2O最适质量浓度的筛选Fig.3 Selection of the optimum concentration of MgSO4·7H2O

3 讨论

王书锦等［15］从黄海、渤海、辽宁近海地区分离得到海洋真菌508株，已鉴定出20多株，主要为青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）等的菌种，其中10%以上菌种的发酵产物具有抗细菌或抗真菌的生物活性；黄菁菁等［16］从福建厦门、晋江及诏安沿海地区采集到的29个样品中分离到390株真菌，有63.3%的菌株表现出了对一种或几种指示菌具有拮抗作用，通过形态鉴定发现，这些菌株以青霉属和曲霉属为主。

微生物在其生命过程中产生的天然代谢产物是天然抗生素的重要来源，它具有在低浓度下选择性地抑制或杀死它种生物或肿瘤细胞的能力。随着抗生素的发展和应用，近年来倍受人们关注的两个问题为：1）细菌及真菌耐药性的增加致使抗生素的疗效有所下降；2）一些不致病的菌成为条件致病菌，在临床上有一定的威胁［13］。微生态活菌制剂主要以乳酸菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌为主，不仅具备与抗生素相似的调节肠道等功能，且不产生耐药性、不伤身体，具有促生长之功效，是抗生素的理想替代者。而汤姆青霉PT95菌株是否也能代谢产生抗生素，这需要进行不断的筛选优化等进一步的研究。

本研究通过选取7种常见的细菌或真菌作为指示菌株，采用牛津杯法和滤纸片法用汤姆青霉PT95的发酵液对这7种菌进行了抑菌活性试验，发现汤姆青霉PT95发酵液中存在某些抑菌物质，尤其是对枯草芽孢杆菌具有较强的抑菌活性，同时也获得了抑菌试验的最佳培养条件。以此为基础，本文还采用牛津杯法测定了汤姆青霉PT95抑制枯草芽孢杆菌的最小质量浓度，并采用单因素试验对培养基进行了优化。从试验结果发现，汤姆青霉PT95菌株发酵液的冻干粉对枯草芽孢杆菌有抑菌活性，最小抑菌质量浓度为0.64 mg/mL。本研究结果表明优化培养有助于提高汤姆青霉PT95的抑菌活性，而其中的抑菌机理值得我们进一步深入研究。