关帝山林区不同退化程度草地群落类型土壤细菌群落组成及生物多样性研究

韩晓丽，黄春国，张芸香，郭晋平*

（山西农业大学 a.林学院；b.农学院，太谷 030801）

关帝山林区位于山西省境内的吕梁山脉中段，属于典型暖温带大陆性季风气候区［1］，区域内植物种质资源多样，森林覆盖率极高。其中，华北落叶松（Larix principis-rapprechtii）和云杉（Picea asperata）等天然次生林集中分布，而以山蒿（Artemisia brachyloba）、中亚苔草（Carex stenophylloides）、蒲公英（Taraxacum mongolicum）、车前草（Plantago asiatica）、东方草莓（Fragaria orientalis）及禾草科（Gramineae）等为主要优势植物种的草地植被群落类型也星罗棋布［2-3］，其在保持土壤、调节气候、涵养水源及保护生物多样性等方面均发挥关键作用［4-5］。由于受气候变化、环境因子及人畜干扰等因素影响，该区域内草地植被群落存在不同程度的退化现象，导致其质量衰退、群落多样性降低、生物生产力下降和水土流失的发生，直接或间接影响植被群落生态系统多样性和生态环境服务功能，给当地生态系统平衡和经济可持续发展造成了严重威胁［6-7］。

地上植物群落、土壤微生物群落及二者间耦合互作均对山地草地生态系统服务功能产生重要影响［8］，且土壤微生物是草地生态系统物质循环和能量转移的主要参与者［9］，常作为评价草地生态系统土壤质量状况、草地发育与演替的重要生物学指标［10］。与真菌、放线菌和土壤原生动物等土壤微生物相比，土壤细菌是第一大重要类群，约占到土壤微生物总量的70%～90%。土壤细菌在生物地球化学循环过程中发挥着重要作用［11］：驱动和调控土壤中各养分元素的矿化、降解和转化等生物学过程，对植物生长和生物产量也产生重要影响［12］；直接参与土壤中氮素的氨化、硝化、反硝化和生物固持等生物化学过程［13］，对土壤有机质降解和土壤碳循环过程也发挥关键作用［14］。因而，土壤细菌群落组成及生物多样性成为诸多学者关注和研究的焦点［15］。

Biolog-ECO微平板检测法［16］、变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）指纹图谱技术［17］和磷脂脂肪酸（phosphohpids fatty acids，PLFA）生物标记法［18］等技术在鉴定土壤细菌群落组成、功能及生物多样性等方面已得到广泛应用。而高通量测序技术［19］以其高通量、低成本、准确率高和数据信息量大等优势，被广泛应用于鉴定和分析土壤细菌群落结构及生物多样性。因此，本研究选择关帝山林区3种典型退化草地植被群落类型为研究对象，采用高通量测序技术分析不同退化程度草地土壤细菌群落组成及生物多样性的空间分布格局及差异性特征，为阐明土壤细菌群落在草地生态系统土壤碳、氮等养分代谢循环过程中的重要调控机理提供科学依据，对揭示关帝山林区草地生态系统地下部分的生物与环境因子格局及生态学过程起到了重要的实践指导意义。

1 材料与方法

1.1 样地概况

样地位于吕梁山脉中段关帝山林区的山西省庞泉沟国家级自然保护区内，该区域属于典型暖温带大陆性季风气候，植物资源丰富，生物多样性较高，年平均气温4.2℃，无霜期100～125 d，年降雨量822.6 mm，且集中于7～9月，海拔梯度1 600～2 831 m。土壤类型呈垂直分布带，自下而上依次为：黄绵土、山地褐土、山地淋溶褐土、山地棕壤和亚高山草甸土。选取3种具代表性的典型草地群落类型作为研究对象，各类型草地存在不同程度退化，根据张金屯［6］山西高原草地退化分级划分标准，结合牲畜放牧、人类干扰及植物种类组成和土壤状况，将退化系列划分为轻度退化草地（light degrade grass land，LDG）、中度退化草地（medium degrade grass land，MDG）和重度退化草地（heavy degrade grass land，HDG）。各个样地的详细的特征如表1所示。

同时，在每种草地群落类型样地内分别设置3个2 m×2 m的样方，样方间距大于10 m。采用混合多点取样法分别采集0～10 cm（A层）和10～20 cm（B层）土壤样品，并进行过筛（2 mm）去除动植物残体和杂质等。采用四分法留取混合土样约10 g，然后使用50 mL离心管装封并放入液氮及冰盒中携带回实验室，放置于-80℃冰箱内以备提取土壤DNA。

1.2 细菌16S rRNA基因测序

土壤细菌群落组成及生物多样性采用第二代高通量测序平台（Illumina Miseq）进行测序分析。其中，PCR扩增引物为：520F（5'-GCACCTAAYTGGGY-DTAAAGNG-3'）和 802R（5'-TACNVGGGTATCTAATCC-3'）。PCR扩增反应体系：2μL的纯化DNA，5μL的Q5反应缓冲液（5×），5μL的Q5高保真GC缓冲液（5×），0.25μL的Q5高保真DNA聚合酶（5 U/μL），2μL的dNTPs液（2.5 mmol/L），上游引物和下游引物（10μmol/L）各1μL，8.75μL的去离子水。PCR扩增反应条件：98℃预变性2 min；98℃变性15 s；55℃退火30 s；72℃延伸 30 s，27个循环；最后 72℃延伸 5 min。PCR扩增产物在4℃保存，并用Agencourt AMPure Beads （Beckman Coulter，Indianapolis，IN，USA）试剂盒纯化处理，使用PicoGreen dsDNA Assay Kit（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）检测试剂盒对扩增产物进行荧光定量分析。Illumina MiSeq高通量测序和分析委托上海派森诺生物科技有限公司进行。

表1 不同退化程度草地群落类型主要特征Tab.1 Main features of different degeneration grassland community types

1.3 数据统计分析

测序序列数据分析主要采用QIIME和R软件包（v3.6.3）进行，不同草地群落类型的土壤细菌群落组成聚类热图分析和α多样性（Chao1和Shannon）均根据操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）矩阵列表中各样本物种相对丰度计算获得，使用SPSS 20.0（SPSS Inc.，Somers，NY，USA）软件对细菌群落生物多样性及优势菌群相对丰度进行方差分析（analysis of variance，ANOVA）和多重比较，采用95%置信水平上Turkey-HSD检验进行差异性显著的认定。

2 结果与分析

2.1 土壤细菌群落α多样性

不同退化程度草地群落类型和土层土壤细菌群落生物多样性存在显著性差异（图1）。其中，重度退化的苔草草地群落类型（Carex stenophylloidesgrassland，CS）表层土壤（0～10 cm）细菌群落α多样性（Chao1和Shannon指数）最高，轻度退化的蒿草草地群落类型（Kobresia grassland，KG）底层土壤（10～20 cm）细菌群落α多样性最低；同一草地群落类型不同土层之间土壤细菌群落α多样性也差异性显著（Shannon指数），轻度退化的KG和重度退化的CS表层土壤（0～10 cm）细菌群落α多样性显著高于底层土壤（10～20 cm），而中度退化的沙棘灌丛草地群落类型（Hippophae rhamnoidesshrubs grassland，HR）土壤细菌群落α多样性底层土壤（10～20 cm）显著高于表层土壤（0～10 cm）。

图1 不同草地类型和土层土壤细菌群落α多样性分析Fig.1 Soil bacterial community alpha diversity among different grassland community types and soil layers

2.2 土壤细菌群落组成及优势菌群

不同退化程度草地群落类型和土层土壤细菌群落组成及优势菌群相对丰度含量存在显著性差异。由图2可知：相对丰度含量排名前十的细菌门中，变形菌门（Proteobacteria）和蓝细菌门（Cyanobacteria）在轻度退化的KG底层土壤（10～20 cm）中相对丰度含量最高，显著高于其他草地群落类型和土层，属于明显的优势菌群；浮霉菌门（Planctomycetes）和迷踪菌门（Elusimicrobia）在轻度退化的KG表层土壤（0～10 cm）中相对丰度含量最高；芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）在重度退化的CS底层土壤（10～20 cm）中相对丰度含量最高；酸杆菌门（Acidobacteria）在轻度退化的KG表层土壤（0～10 cm）和中度退化的HR底层土壤（10～20 cm）中相对丰度含量最高，且二者之间差异性不显著；放线菌门（Actinobacteria）在中度退化的HR表层土壤（0～10 cm）中相对丰度含量最高；硝化螺旋菌门（Nitrospirae）在KG表层土壤（0～10 cm）、HR底层土壤（10～20 cm）和CS底层土壤（10～20 cm）中相对丰度含量最高，且相互之间差异性不显著；绿弯菌门（Chloroflexi）在重度退化的CS表层土壤（0～10 cm）中相对丰度含量最高，显著高于其它草地群落类型和土层，属于明显的优势菌群；拟杆菌门（Bacteroidetes）在KG表层土壤（0～10 cm）和HR表层土壤（0～10 cm）中相对丰度含量最高，且二者之间差异性不显著。

图2 不同草地类型和土层土壤细菌优势菌群相对丰度含量分析Fig.2 Relative abundance of soil bacterial dominant phyla among different grassland community types and soil layers

由表2可知：相对丰度含量排名前十的细菌属中，涅瓦河菌属（Nevskia）、芽孢杆菌属（Bacillus）、鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、乳酸球菌属（Lactococcus）、假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）和无色杆菌属（Achromobacter）6个属，在轻度退化的KG底层土壤（10～20 cm）中相对丰度含量最高，显著高于其它草地群落类型和土层，属于明显的优势菌群；红游动菌属（Rhodoplanes）在中度退化的HR底层土壤（10～20 cm）中相对丰度含量最高；节杆菌属（Arthrobacter）在重度退化的CS表层土壤（0～10 cm）中相对丰度含量最高，显著高于其它草地群落类型和土层，属于明显的优势细菌属；浮霉状菌属（Planctomyces）在轻度退化的KG表层土壤（0～10 cm）中相对丰度含量最高，且与HR表层土壤（0～10 cm）中相对丰度含量差异不显著；小月菌属（Microlunatus）在轻度退化的KG底层土壤（10～20 cm）和重度退化的CS表层土壤（0～10 cm）中相对丰度含量最高，且二者之间差异性不显著。

表2 不同草地类型和土层土壤细菌优势菌属相对丰度含量Tab.2 Relative abundance of soil bacterial dominant genera among different grassland community types and soil layers

同时，根据不同草地群落类型和土层土壤细菌优势属聚类和热图分析可知（图3），6个样本聚类为两大类群，即：不同草地群落类型的表层土壤（0～10 cm）和底层土壤（10～20 cm）类群。轻度退化的KG和中度退化的HR在同一土层深度土壤中细菌群落组成相似度较高，但不同土层深度之间土壤细菌群落组成差异性显著。重度退化的CS与轻度退化的KG、中度退化的HR相比较，在不同土层深度土壤中细菌群落组成差异较大，且不同土层深度之间差异性显著。

3 讨论

土壤细菌是草地生态系统物质循环和能量流动的主要驱动因子，其群落组成及生物多样性对土壤肥力、理化性质及土壤健康状况等产生重要影响［20］。本研究结果表明，不同退化程度草地群落的土壤细菌α多样性存在显著性差异，且土层深度因素也显著影响土壤细菌的α多样性（图1）。Tardy等［21］的研究表明土壤细菌群落生物多样性决定着土壤细菌群落结构及其生态服务功能。此外，Fierer等［22］的研究揭示了土壤细菌群落对土壤环境中各生态因子也产生了相应作用。土壤细菌群落受气候变化、干扰程度、草地类型及植物群落组成等因素的影响，会直接参与土壤有机质的形成和降解过程，对土壤中有机质含量产生重要影响［23-24］。重度退化的苔草草地表层土壤细菌α多样性最高（图1），其高丰度含量的节杆菌属（Arthrobacter）（表2）具有很强的抗旱性和耐饿性，可降解土壤中的有机化合物质，使得土壤有机质含量降低［25］，从而引起土壤退化及草地生态系统退化。同时，牲畜放牧［26］和人为干扰［27］等外因会显著影响和改变土壤细菌种群数量、群落结构及生物多样性，引起土壤硬度和有机质含量等土壤理化特性发生变化，造成土壤退化［20］。

图3 不同草地群落类型和土层土壤细菌优势属聚类热图Fig.3 Heat map and cluster of soil bacterial dominant genera among different grassland community types and soil layers

“缺氮”是退化草地土壤环境养分失衡的重要表现形式之一，其严重制约着退化草地生态系统的恢复和平衡［9］。而土壤细菌直接参与土壤氮素养分的循环与转化过程，决定着土壤肥力的高低及健康状况［28］，对植物的生长发育和群落演替产生重要影响［29］。本研究结果相对丰度排名前十的土壤细菌门（属）中多数是土壤反硝化细菌［绿弯菌门（Chloroflexi）、节杆菌属（Arthrobacter）等］，其相对丰度含量随草地退化程度增加而显著增高（图2和表2），其主导的反硝化作用易引起土壤中氮素养分流失，造成土壤“缺氮”和加速草地退化［30-31］。而芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）属于革兰氏阴性细菌，能利用和降解土壤中的主要碳源物质，可显著降低土壤有机质含量［32］，其相对丰度含量在重度退化的苔草草地底层土壤中最高，表明由土壤细菌活动导致土壤有机质含量降低可能是引起关帝山林区草地退化的主要原因之一。

同时，本研究还发现土层深度因素对关帝山林区草地土壤细菌群落组成及生物多样性影响差异性显著，这与前人研究结果一致，主要是由于土壤有机质和养分含量等生态因子随土层深度增加而显著降低的缘故［33］。